DNA原位杂交技术

本法可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合。其后，生物素化的分子可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测。小分子的水溶性生物素对细菌蛋白链霉亲和素具有高度亲和力是本法的设计基础。 NHSB：N-羟基琥珀酰亚胺生物素（有商品供应） 0.1 mol/L 碳酸氢钠缓冲液，pH 8.0 双蒸水（注意去除游离氨基），用以配制碳酸氢钠缓冲液或硼 ...

下面的操作方法可以使约3~5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。 1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。 ...

RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测，有两种方法可以选择。 方法一、用标准DIG测试条比较鉴定 使用测试条鉴定包括两个步骤：首先，将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度，并点样到空白测试条上（对照测试条已用一系列浓度点样）；其次，将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应，然后根据对照测试条计算备测样品的浓 ...

PCR可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过对光密度扫描来进半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。 例如我们想知道某一特定基因在特定组织中的表达量。早期定量PCR技术需要特别的训练，严格的测试和特别准确的加样。早期定量PC ...

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有 ①模板核酸的制备。 ②引物的质量与特异性。 ③酶的质量及。 ④PCR循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板： ①模板中含有杂蛋白质。 ②模板中含有Taq酶抑制剂。 ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。 ④在提取制备模板时丢失过多，或吸 ...

引物（Primer）在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。 自然中存在有生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反 ...

1. 如何测定引物的OD值？ 用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2~0.8之间（吸光度太高或太低会有较大的误差）。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1 ml 并在1 ml 标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。 举例：您拿到一管干粉的DNA ...

引物（primers）： 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。引物的重要性：在整个PCR体系中，引物占有十分重要的地位。 引物的重要性： 在整个PCR体系中， 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能 ...

一、GC% GC含量 对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。 二、Degeneracy 多义性 当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3‘末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。 三、3&rsqu ...

1、引物延伸分析（primer extension analysis） 引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数 ...

1. 在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解。 以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活： （1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。 （2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活 （3）立即将样品置于RNAlater? Tissue Collection：RNA St ...

内皮细胞培养至90~100% ↓ PBS洗细胞3遍（室温） ↓ 预热的蛋氨酸和无血清的培养基（MEM）LL nL 50 μM（分子量，383.5，50 mM，25 mg 溶于二甲基硫氧化物DMSO中1304 μl） 在37℃下孵育2小时。 ↓ 等同于（同步）MEM加1.5%BSA+10 μM LLnL50 μM 在37℃下孵育10 ...

一 、组织RNA提取 1. 最好新鲜组织，这样RNA提取的效果比较好，这是肯定的。 2. 如果不是新鲜的（最好在半年之内，-80℃或者液氮中冻存的）组织，注意不要反复冻融，从冰冻状态拿到0~4℃，注意不要拿到常温，待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织，称重后，放到预冷的匀浆器中，然后加入一定量的TRIZOL试剂，然后匀浆。注意：速度不要太快，要匀一会挺一会，否 ...

bioanalyzer 到底能干什么？下面的图表会给你一个较为清晰的了解和认识，看来用处还不少呢！bioanalyzer在检测RNA的质量方面绝对是有独到之处的，相信大家看完我所提供的图片就会更加相信这一点的。 bioanalyzer的操作也是非常简单容易的，可以简单的来说上样，点击软件的start，然后40分钟左右看结果。这个时间与你的样本数量和片子类别有关系，通常来说，smallRNA和D ...

一、污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。 1. 划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： （1）标本处理区，包括扩增摸板的制备。 （2）PCR扩增区，包括反应液的配制和 ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 污染原因 （1）标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的 ...

减少引物二聚体的方法 1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法。 2. 可能模板有问题。 3. 模板浓度过小，适当加大模板量。 4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度。 5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷 ...

PCR产物的电泳检测时间一般为48 h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于48 h 后带型不规则甚致消失。常见问题如下： 一、假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 ...

目的 探索一种方法，能将PCR产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来，并且最好能去掉200 bp 以下的小片段DNA，用于DNA测序。 有文献和方法说，不同浓度的PEG能沉淀不同长度的DNA，所以，先做了一下不同PEG浓度对DNA沉淀的作用，见下图，标本是用的50bp DNA Marker，上一行Marker溶解在纯水里面的，下一行Marker溶解在模拟的PCR反应 ...

RNA探针是一段单链cDNA分子，本文总结了RNA探针的分类、制备方法、探针的纯化、杂交前的注意事项，RAN探针效价的测定以及探针的选择。 RNA 原位杂交中的探针 （一）探针的种类 RNA 探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链 cDNA 或 cRNA 分子。 根据在 RNA 杂交中所使用的探针依其来源可分为三种： 即特异性 cDNA、 cRNA 探针和人工合成寡 ...