基因克隆

网络 第五节　寡核苷酸探针的制备 　　利用寡核苷酸自动合成仪，可很简单地合成制备寡核苷酸探针（如15～50bp），这类探针具有以下优点：①短的探针比长探针杂交速度快，特异性强。②可以在短时间内大量制备。③在合成中进行标记制成探针。④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下， ...

网络 第四节　非放射性标记的核酸探针 　　放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。 　　酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针 ...

网络 第三节　放射性同位素标记核酸探针 　　最常用的同位素是α-32PdNTP3HdNTP及35SdNTP，多用缺品平移法、末端标记法，随机引物延伸法和反转录标记法。在以mRNA制备cDNA时，同时掺入标记的脱氧核苷酸，制出cD－NA标记探针。 　　一、缺口平移法 　　在适当的浓度的DNase I作用下在一双链DNA上制造一些缺口，再利用大肠杆 ...

网络 第二节　核酸（基因）探针目的核酸的制备技术 　　一、特异性目的核酸（或基因）的制备 　　核酸分子探针的制备首先需要获得所要的特异性核酸或其片段。可用以下方法制备： 　　（1）直接分离基因核酸：即从基因组上直接用内切酶切下所需基因。 　　（2）化学合成基因核酸：即以单核苷酸为原料，以固相磷酸三酯法合成某一结构完全清楚，分子量较小的寡核 ...

网络 第十九章　核酸（基因）分子探针 第一节　概述 　　从化学和生物学的意义上理解，探针是一种已知特异性的分子，它带有合适的标记物供反应后检测。探针和靶的相互反应如抗原-抗体、血凝素-碳水化合物、亲合素-生物素、受体和配体，以及核酸与其互补核酸间的杂交等反应均属此类。用核酸探针与待检标本中核酸杂交，形成杂交体，再用呈色反应显示。此方法用于疾病的诊断， ...

网络 第四节　石蜡包埋组织的DNA提取及其应用 　　近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。 ...

网络 第三节　分子杂交 　　一、概述 　　前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、R ...

网络 第二节　DNA的变性与复性 　　一、DNA变性 　　DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等），称为DNA变性。加热、改变DNA溶液的pH、或受有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素的影响，均可使DNA变性。 　　通常，可利用DNA ...

网络 第十八章　核酸分子杂交技术概述 第一节　核酸的分子结构 　　一、核酸的化学组成 　　组成核酸的元素有C、H、O、N、P等，其中N含量约为15%～16%，磷含量为9%～10%。由于核酸分子中的磷含量比较恒定，因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定磷含量代表核酸量。 　　核酸经水解可得到多核苷核，因此核苷酸是核酸的基本单位，核酸就是由很 ...

网络 第七节　真皮浸润细胞免疫表达 　　一、T淋巴细胞及其亚群的免疫表达 　　CD3（OKT3，Leu4）对T细胞特异，正常或肿瘤性B细胞不表达CD3；CD4RO（UCHL1）大多数T细胞和T细胞淋巴瘤呈阳性表达，能用于石蜡切片中。二者是常规筛选T细胞的良好标记物。成熟T细胞可分为表达CD4（OKT4、Leu3a）T辅助（TH/I）细胞、CD8（OK ...

网络 第八节　汗腺及汗腺肿瘤的免疫细胞化学特点 　　目前已有多种PcAb和McAb用于汗腺及汗腺肿瘤的研究，这些不同的抗体对汗腺的不同部位有特异性反应，主要用于探讨汗腺肿瘤的组织发生，分化特点以及诊断及鉴别诊断。同时也可用于外科手术切除时，迅速判断肿瘤是否切除干净。现将不同的抗体分述如下。 　　1．癌胚抗原（CEA）　出已证明在大小汗腺的腺体及导管 ...

网络 第六节　免疫细胞化学技术在真皮纤维化性疾病研究中的应用 　　真皮结缔组织由数量不多的细胞和丰富的细胞外基质组成。细胞成分包括成纤维细胞、肥大细胞、巨噬细胞和少量淋巴细胞等。细胞外基质包括：①胶原：真皮中胶原纤维由I型和II型胶原构成，成熟真皮中I型胶原约占胶原的85%，越年幼的皮肤含III型胶原的比例越高。②弹性蛋白。③非胶原糖蛋白：如纤维粘连蛋白。 ...

网络 第五节　真皮与表皮交界 　　真皮与表皮交界不平。真皮乳头与表皮的突起部分（即表皮突）互相镶接。 　　一、基底膜带 　　（一）基底膜带（basement membrane zone BMZ）的结构 　　基底膜带位于表皮真皮连结处，用PAS染色光学显微镜下所见为0.5～1μm厚的均匀一致的紫红色带，称为表皮下基底膜带。 　　1．B ...

网络 附录四　实验室常用技术参数资料 　　一、核酸及蛋白质常用数据 1．核苷三磷酸的物理常数 化合物 分子量 λmax(pH7.0) 1摩尔溶液（pH7.0）中λmax时的最大吸收值 OD280/OD260 ATP 507 259 15400 0.15 ...

网络 附录三　全血细胞培养染色体技术常用试剂配制 　　一、国内实验室应用试剂配制 　　（一）培养液 　　（1）RPMI1640培养液：称取RPMI培养基9.8g，碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml，加双蒸水至1000ml，调节　pH7.2～7.4无菌过滤冻存备用。 　　（2）小牛血清商品：成都生物制品厂。 　　（3）植物凝集素（ ...

网络 附录二　原位杂交组织化学常用试剂及处理 　　一、杂交前准备 　　（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。 　　DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理 ...

网络 附录一　免疫细胞化学常用试剂介绍 　　一、固定剂 　　大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的 ...

网络 第五节　“DNA指纹”与法医鉴定 　　1979年Teffreys根据β珠蛋白基因座位近旁出现的RFLP频率同测定的核苷酸总数，推算出人体基因组的遗传异质性约为每100个核苷酸中有一个差异。后在人体DNA随机片段的文库中分离出高度变异的超变区。从1982年起，分别在人的胰岛素基因，α类珠蛋白基因，肌动蛋白基因和C-Ha-ras-1基因中陆续发现了这些超 ...

网络 第四节　遗传病与肿瘤的基因诊断 　　从DNA水平上寻找确诊遗传病的指标或探讨遗传病和肿瘤的病因等方面，已取得很大成绩，这对产前诊断，早期确诊和突变基因携带者的检出等都有重要意义。所用的方法大体有以下几种。 　　一、分离基因进行结构分析 　　利用DNA离体转化，制备探针，制备基因文库进行筛检，最后鉴定载体中插入DNA片段的特性等一系列技术， ...

网络 第三节　DNA重组实验中常用的技术 　　一、质粒DNA的提取及鉴定 　　（一）质粒DNA的提取及鉴定 　　1．收获细菌 　　（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。 　　（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离 ...