基因克隆

外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌 ...

alimama_pid="mm_10043573_137377_1822161"; alimama_titlecolor="FF9900"; alimama_descolor ="552c55"; alimama_bgcolor="f7f7f7"; alimama_bordercolor="f7f ...

基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。 基因克隆技术包括了一系列技术，它大 ...

功能克隆（funetional cloning）是利用疾病已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋白质基酸缺陷的信息，进行基因定位，进而克隆 该致病基因。以进行的基因克隆 大都是预先测知疾病基因的编码蛋白质，利用其mRNA反转录成cDNA，再用cDNA作探针，从人基因组中“约”出基因本身。然而，绝大多数遗传病的基因产物不明，就无法用功能克隆策略进行基因克隆。 ...

Subcloning should be easy and fast and work every time. The following protocols minimize the number of manipulations required to prepare DNA fragments for ligations thereby both saving time and increa ...

Prepare a ligation mix: Ligation Mix (2x) ...

(adapted from Bruce A. Roe Department of Chemistry and Biochemistry The University of Oklahoma Norman Oklahoma 73019 broe@ou.edu) A. Sonication The generation of DNA fragments by sonication is perform ...

平端连接 通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5—10uT4RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较 ...

所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。 亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。 一、试剂准备 1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶 ...

PCR克隆主要有TA克隆法 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。 但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TA Cloning商标的专利权。 TA克隆方法（Original TA Cloning Kit） 利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动 ...

TA Cloning I. Initial mixture 5 μl dd H2O 1 μl PCR product 1 μl ligation buffer 2 μl TA vector (add second to last) 1 μl ligase (add last) Incubate overnight at 15℃. II. Electroporation 1. Chill cuvettes on ice before starting. 2. Set out electrocompetent JS5 cells to thaw on ice. It is important to keep them on ice. 3. Dry one 100 mg/ml AMP plate for each sample. Add 40 μl of xgal and 40 μl of IPTG to each plate. 4. Add 500 μl of SOC or SOB media to each 5 ml snap cap tube. 5. Heat ligations at

“多莉”的诞生，意味着人类可以利用动物的一个组织细胞 ，像翻录磁带或复印文件一样，大量生产出相同的生命体，这无疑是基因工程研究领域的一大突破。 人们剪下植物枝条，扦插到土里，不久就会发芽，长出新的植株，这些植株是遗传物质组成完全相同的植株，这就是“克隆 ”。还有将马铃薯等植物的块茎切成许多小块进行繁殖，由此而长出的后代也是“克隆 &rd ...

competent cells (DH5alpha at competency of 108 cfu/µl of pUC18). The transformation procedure it self is very similar to a standard CaCl2 transformation. Place 100 µl of TB buffer in a tub ...

第一节 概 述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆 较小的DNA 片段(＜10kb)且结构简单质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆 从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段 然后体外使两者相连接 再用所得到重组质粒转化细菌即可完成。但在实际工作中 如何区分插入有外源DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中 ...

The overall sequence of events is: • Titer and plate out phage • Lift plaques onto filters and prepare them for screening • Make a probe • Hybridize the probe to the filters &b ...

Linker Ligation (with T4 ) DNA Ligase In a microcentrifuge tube prepare a solution of blunt ended, dephosphorylated DNA (100-500ng) in TE buffer (5-7µl). Add 1-2µg of phosphorylated linkers in 5µl of TE buffer. Add: 10X ligation buffer 2µl, 50% PEG 4000 solution 2µl, deionized water to 20µl, T4 2u. Vortex the tube and spin down in a microcentrifuge for 3-5 seconds. DNA Ligase Incubate the mixture for 1 hour at 22℃ . Inactivate T4 DNA Ligase by heating the reaction mixture at 65℃ for 10 minut

Instructions Modified for Simpson Lab1.PCR: Perform a standard PCR reaction using taq polymerase. (Do not use tfl as the PCR product must have a 3' adenine overhang that only taq generates.) Include an 72℃ extension step for 7 to 30 minutes at the end of the reaction to ensure that all products are full length a ...

alimama_pid="mm_10043573_137377_1822161"; alimama_titlecolor="FF9900"; alimama_descolor ="552c55"; alimama_bgcolor="f7f7f7"; alimama_bordercolor="f7f ...

alimama_pid="mm_10043573_137377_1822161"; alimama_titlecolor="FF9900"; alimama_descolor ="552c55"; alimama_bgcolor="f7f7f7"; alimama_bordercolor="f7f ...

alimama_pid="mm_10043573_137377_1822161"; alimama_titlecolor="FF9900"; alimama_descolor ="552c55"; alimama_bgcolor="f7f7f7"; alimama_bordercolor="f7f ...