目的基因的亚克隆

实验题目 ：目的基因的亚克隆

一、实验目的

1、掌握细菌基因组提取的方法和原理。

2、掌握限制性核酸内切酶处理基因组及其结果分析。

3、掌握基因片段回收的方法。

二、实验原理

细菌基因组的提取：通过碱法或者酶法裂解细菌之后，可以将胞内的核酸和蛋白质全释放出来。DNA溶于1mol/L的NaCl中，不溶于0.14mol/L的NaCl，而RNA溶于0.14mol/L的NaCl不溶于1mol/L的NaCl中，通过溶液中盐浓度的变化可以将DNA和RNA分开。氯仿－异戊醇法除去蛋白，2倍体积乙醇将DNA沉淀出来。

限制性核酸内切酶只作用于特定的位点，处理基因组后只会得到有限的片断。通过单酶切或者多酶切后电泳检验就可以得到与物种本身有关的特定的图谱。

电泳后选定目的基因的条带，紫外灯下将含有目的基因的凝胶切下，使用凝胶回收试剂盒，将凝胶溶化后，通过吸附柱时，核酸片段就吸附在柱上，洗脱液洗脱后加入2倍体积乙醇，核酸沉淀，TE溶解沉淀，核酸片段得到回收。

三、试剂与器材

1、试剂 E.coli JM109，牛肉膏，胰蛋白胨，NaCl，微量细菌基因组抽提试剂盒（上海生工），BamH I、Xho1 核酸内切酶（Takara），NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)，凝胶电泳回收试剂盒

2、器材 高速台式冷冻离心机，水平电泳仪，漩涡混合仪，紫外检测仪，凝胶成像分析系统，微量移液器及吸头。

四、操作方法

1．使用LB培养基活化、培养菌体。

2．离心收集菌体，根据试剂盒说明提取基因组。

3．限制性酶处理基因组。

4．E.coli JM109的基因组经过限制性内切酶处理后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统将酶切图谱采集下来并对其分析。

5．紫外灯下将需要回收的核酸片段切下来，使用凝胶回收试剂盒回收DNA片段。

6．电泳检测回收的核酸片段。

五、关键步骤与注意事项

1．菌体培养过程要严格无菌，染菌后提取得到的基因组会成多条带，酶切的图谱也会比较复杂。

2．基因组提取过程中所使用的器材要严格灭菌，防止核酸酶降解基因组。

3．基因组提取过程不可以剧烈振荡，防止DNA断链。

4．在内切酶最适条件下充分处理基因组，得到正确的图谱。

5．琼脂糖溶化要充分。

6．切下凝胶时要注意防护紫外线，电泳结束之后尽快将胶条切下来，凝胶条要窄，脱尾部分不回收。

六、思考题

1．BamH I、Xho1的作用位点分别是什么？

2．内切酶分析基因图谱的注意事项？

3．琼脂糖溶解不好会对核酸片段回收产生什么影响？

4．凝胶回收的注意事项？