基因克隆

第二军医大学细胞生物学教研室；上海200433　何志颖；姚玉成（综述）；胡以平（审校）关键词：EST技术；“电子”基因克隆；生物信息学；基因摘要： 随着人类基因组计划的顺利进行，EST技术被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域。利用人类基因组研究不断产生的数据，从ESTs即cDNA的部分序列入手，通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA文库等繁锁实验室工作。本文从原理、 ...

1．目的学会用酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。2．原理利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片段的克隆菌落。3．器材旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。4．试剂LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提 ...

看到一本权威的E文教科书关于gene knockout的过程，插图如下http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bookres.fcgi/mcb/ch8f34.gifFigure 8-34. General procedure for producing gene-targeted knockout mice. Embryonic stem (ES) cells heterozygous for a knockout mutation in a gene of interest (X) a ...

上海##生物技术有限公司开展免费赠送Seamless Cloning kit活动。任何科研用户填写完整以下问卷都有获赠一个单价688元的Seamless Cloning kit的机会。本次活动计划赠送50个Seamless Cloning kit，本次活动赠送的kit为正式产品，非试用装。Seamless Cloning kit采用与传统方式不同的基因克隆方法，可以将目的基因定点，定向克隆到目的载体，具有简单，快速，高效的特点。可以绕过传统 ...

一般常识，单拷贝克隆产量低，高拷贝克隆稳定性差，一直让研究者在克隆表达时难以选择。蛋白的表达就有诱导表达系统，可以实现人为地控制蛋白的表达时间和表达量——现在连质粒的拷贝数可以借助诱导的方法来人为控制了！Epicentre的专利技术——CopyControl克隆系统能够让您共享单拷贝和高拷贝的优点。CopyControl克隆首先以单拷贝形式生长——单拷贝可以确保插入稳定及成功克隆编码毒性基因序列——在需要的时候， ...

近年来，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因组编辑技术可谓是层出不穷，尤其是CRISPR/Cas9，一出现便在全球范围内掀起一股热潮。同时，各大公司也开发出一系列相应的产品，其中一种至关重要的就是基因敲除阳性克隆筛选的试剂。目前用的比较多的有CELI酶，CELI是植物来源的一种特异性识别碱基错配的酶，活性高，不会产生假阳性。而且CELI酶是目前生物界发现的唯一能准确切割异源双链DNA中存在错配位点的酶 ...

如何保证2天获得正确的克隆？基本操作步骤:Day1：·A:PCR--电泳回收--酶切（1-2小时）--PCR快纯试剂盒回收；·B:载体DNA的酶切（1-2小时）--?如有需要，进行电泳回收。·注：A和B可同步进行节省时间，然后进行连接（设置载体自连对照），室温0.5-1小时，转化Day2:·观察过夜培养的平板上的克隆数：当目的连接板上的克隆数较较对照连接平板上的克隆数多3倍以上时，·可以直接随机挑选2-3个克隆进行测序分析。·注：基本不用 ...

从2013年1月份开始到现在，近2年的时间里，CRISPR/Cas9技术的应用被来自全球优秀的科学家们不断的扩大。其中包括基因敲除，定点突变，定点整合，基因沉默，基因定位和CHIP等多个领域，而且这个技术的应用领域还在不断的被扩大。笔者基于多年的基因重组经验（系统的研究过ZFN/IOS/TALEN/CRISPR重组技术），以及采用CRISPR/Cas9技术构建超过50多个株系的经验，重点谈一谈构建敲除细胞株系时，如 ...

近年来，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因组编辑技术可谓是层出不穷，尤其是CRISPR/Cas9，一出现便在全球范围内掀起一股热潮。同时，各大公司也开发出一系列相应的产品，其中一种至关重要的就是基因敲除阳性克隆筛选的试剂。目前，市面上只有Genloci的CruiserTM、Transgenomic的SURVEYOR和NEB的T7EI这三种产品和测序这种方法，被用于基因敲除阳性克隆的筛选。然而，SUR ...

本方法的核心部分是医科院基础所的生化脂蛋白组的吴刚老师所创，我在其基础上进行了一些改动，主要是DNA回收上采取了更简单的方法。（本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆的情况。对于分步酶切制作片断，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。）一、片断平移的克隆（也适用于多片断连接）简介：将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3μL ，要切出小片断的质粒B酶切7μL；琼脂糖回收胶电泳；切胶回收来自质粒A的大片段，和来自 ...

阳性克隆筛选方法汇总——基于ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9基因敲除方法近几年来，基因重组的技术层出不穷，包括TALEN和CRISPR/Cas9在内的重组技术给基础研究提供更为方便和快捷的分子生物学工具。关于这些技术的具体原理和操作细节，这里不做展开介绍，主要谈一谈在用这些技术进行细胞株构建的过程中，如何做才能加快阳性克隆筛选的步伐。阳性克隆筛选的过程为：将单个细胞，采用有限稀释法接种到96孔板中，待到 ...

基因工程（DNA重组技术）是在离体条件下对不同生物的遗传物质（DNA）进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。自1983年首次获得转基因植物以来，便深受育种工作者青睐，得到了蓬勃地发展。至今已有30多科约200多种植物转基因成功； ...

小崔的转基因美国行的录像风传互联网：http://tv.sohu.com/20140301/n395869190.shtml小崔这个视频发布不久，微信群就有不少人在转发，可见影响不小。里面太多 he said she said，结果是怀疑者更怀疑了。有朋友批评小崔缺乏科学素养，以其昏昏，使人昭昭，水平不够。也许是吧。可小崔有新闻人的资格和耐力干劲，虽然缺乏科学理解能力。而某些据说有科学学养的人，又专门爱忽悠，欺负国内老百姓没在美国生活过 ...

一、Lighteningssembly Cloning Kit 传统克隆方法：引物设计合成、PCR、连入克隆载体、酶切获得插入片段，酶切获得线性载体，连接获得重组质粒。需酶切，引物设计受酶切位点限制；需连入克隆载体；步骤多，耗时长；效率低。 北京康碧泉公司代理的Gene-Foci试剂盒的克隆方法：引物设计合成、PCR获得插入片段，PCR或酶切获得线性载体，连接获得重组质粒。无需酶切 ...

网络 第四节　样品的前处理 　　样品的正确收集与处理，是蛋白质及多肽激素放射免疫分析取得成功的前提。不同的样品与测定项目，其前处理有不同的要求。下面以神经肽测定为例，介绍样品的前处理方法。 　　一、脑、脊髓与垂体中神经肽的提取（以大鼠为例） 　　1．大鼠称重后，在尽量安静的情况下，迅速断头、取躯干血。 　　2．尽快取下全脑、脊髓（某段）与 ...

网络 第三节　结合和游离部分的分离 　　放射免疫分析时加入的抗原和抗体的量极微，反应所形成的复合物并不能成为肉眼所能辨认的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必须分别测量与抗体结合的（B）和游离的（F）抗原，所以，B、F的分离是放射免疫分析中的一个重要环节　。根据抗原―抗体复合物与游离抗原理化性质或免疫学性质的不同，可采取各种分离技术。 　　一、对分离方法 ...

网络 第二节　放射性碘标记 　　在RIA中，标记抗原质量的优劣，直接影响测定结果，必须制备比放射性强、纯度高的标记抗原，并保持免疫活性不受丧失。 　　一、同位素的选择 　　同位素有稳定性和放射性两种。放射性同位素可利用其衰变时放出的放射线进行测量，这种测量较灵敏而方便，故多用放射性同位素。标记抗原，常用的放射性同位素有3H、14C、131I和1 ...

网络 第八章　蛋白质与多肽激素的放射免疫分析 第一节　概述 　　1960年，美国学者Yalow 和Berson 创立了放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），并首先用于糖尿病人血浆中胰岛素含量的测定。这是医学和生物学领域中方法学的一项重大突破，开辟了医学检测史上的一个新纪元。它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义 ...

网络 第五节　其它免疫电镜技术 　　一、凝集素电镜标记技术 　　凝集素的特性及标记原理详见第五章　，近年来，凝集素电镜标记技术应用日益广泛，且获得较为满意的效果。凝集素电镜标记技术方法较多，常用的有凝集素―酶（常用为HRP）、凝集素―生物素―酶电镜标记技术。现将凝集素―酶电镜标记技术（包埋前染色）简介如下（Sterit 和Kreatzberg1987 ...

网络 第四节　免疫电镜胶体金标记法 　　金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。它是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地 ...