总结一下最近构建质粒的心得，最近构建这个质粒已经有2个月了，一直没成功，到最近才有点眉目，只等测序了。其实质粒构建很容易，但有时候就是得不到结果，对于大片段（》3kb）要克隆到载体里，还是有难度的。首先介绍一下背景，我的质粒是pcDNA3.1+,片段是4371bp，刚开始我是用cDNA跑PCR，用的是高保真的酶，PCR产物也很完美，浓度也不低，用的是NotI单酶切，然后把质粒去磷酸化后再做连接，在百度上搜索到有人介绍说 ...
我也是从网上收集过来的，仅供相关人员参考！DIG标记的Northern杂交试验指导一、 RNA提取方法一、改良异硫氰酸胍提取法试剂及其配制异硫氰酸胍变性液：贮存液－在含484ml 水（经DEPC处理）, 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍，加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用（不超过3个月）。工作液－在每50ml贮存液中加入0.3 ...
PCR技术在分子生物学领域的重要性自不必多说，各种新的PCR技术也不断涌现。引物的设计是进行各种PCR的重要前提条件。虽然现在有很多软件可以设计并评价引物，但在实际的PCR扩增过程中，必须对反应体系和反应条件进行优化，尤其是引物浓度，Mg2＋浓度，退火温度等。有时候无论我们如何优化，也拿不到目的产物，只能重新设计。鉴于在引物的设计和合成过程中所花费的时间、精力和财力（尤其对于新手而言），本着资源共享的原则，建立丁香 ...
本版有较多关于promoter的讨论，其中不乏精彩好贴，本人也受益较多，现试着总结归纳了如下，希望对大家有用： 启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。在基因表达的调控中，转录的起始是个关键。常常某个基因是否应当表达决定于在特定的启动子起始过程。启动子一般可分为两类: (1)一类是RNA聚合酶可以直接识别的启动子。这类启动子应当总是能被转录。但实际上也不都如此，外来蛋白质可对其有影响， ...
国家人类基因组北方研究中心对外开展重组腺病毒构建包装服务通过与美国Vector Biolab公司合作，国家人类基因组北方研究中心（北京诺赛基因组研究中心有限公司）利用优越的实验条件和训练有素的科研人员，成功构建的一个集克隆、包装、扩增、纯化为一体的重组腺病毒构建技术平台。从2005年7月成立腺病毒小组并开展实验至今，为课题组内部完成包装200多个腺病毒，为Vector Biolab公司成功包装近300个腺病毒，并且 ...
New England Biolabs（NEB 公司）隆重推出蛋白质标记 SNAP-tag 最新技术，该项技术可以在活细胞及固定细胞中研究蛋白质的功能和定位。SNAP-tag 技术能将哺乳动物细胞体内蛋白质成像并且体外捕获蛋白质，为研究蛋白质提供了强有力的工具。其工作原理是：构建基因，表达融合蛋白质，再与多种荧光基团、生物素或磁珠形成共价结合。为了使用方便，NEB 提供两套系统：一套是标记物可以直接自我标记构建好的融合蛋白质（SNAP-tag 和 ...
我们将如何应对海量的基因信息新一代测序技术带给人们大量遗传信息的同时，却成为限制其广泛应用的一个障碍。1980年，英国生物化学家Frederick Sanger与美国生物化学家Walter Gilbert建立了DNA测序技术并获得诺贝尔化学奖，至今已有近三十年了。在这三十年，DNA测序技术取得了令人瞩目的进展。目前已进入市场的循环阵列测序平台采用的是与Sanger生物化学测序方法完全不同的原理。在过去几年，应用极 ...
核酸序列的一般分析流程1.1 核酸序列的检索http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide1.2 核酸序列的同源性分析1.2.1 基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi1.2.2 核酸序列的两两比较http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html1 ...
第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节 概 述 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达 ...
RNAi这个东西蛮新的，也是比较难理解的。所以做这个题目的整理工作难免闹笑话，请大家多多指正。今天，武汉的DXYer小聚一下，感谢lad莅临武汉促成了这次聚会。同时也感谢lad把召集的重任交给我。我更加感谢能来捧场的武汉朋友们。同时感谢对此次活动关注的朋友，我就不一一列举他们的名字了。我希望以这一帖送给所有的关心我、爱护我、教育过我、帮助过我的朋友。谢谢你们!(时间问题，我没有整理成超链形式，但并不影响大家检索，不好 ...
EB（溴化乙锭）到底有多毒？随着每年各类化学物质进入市场，产生残留物的数量不断增加，健康和环境成为日益关注的问题。虽然许多实验中使用的化合物是有毒的，很多都是潜在的危险，但一些化学品没有适当的危险性分类，在日常实验中被广大科研工作者所忽略。什么是EB溴化乙锭？在研究数以千计的实验室残留性有毒物质，最值得一提的就是溴化乙锭（EB；3, 8-二氨基-5-乙基-6-phenylphenanthridinium甲基溴），该物质的潜 ...
到医院实习之前，我有幸跟随我的恩师，利用课余时间做了两年多的基础科研。从不懂规矩到渐入佳境，期间学习了很多东西，在此感谢我的恩师！我们是生物化学教研室，这两年的时间里我做了很多生化方面的实验。像细菌培养、细胞培养、PCR、western-blot、MTT测细胞增殖能力，这些实验都有商品化的试剂和推荐的操作方法，做起来，难度并不大。唯独让我感到苦恼的就是ShRNA表达质粒的构建这部分，它耗费了我们很多的精力，虽然最终 ...
重组质粒一月有余，颇有心得，与各位战友分享如下：1：关于双酶切的Buffer，一直是酶切的重点。有人喜欢A酶切完回收再B酶切，其实可以通过NEB网站上查询大部分双酶共切的Buffer问题，常见的双酶搭配甚至可以找一本TAKARA或者其他公司的Catalog，内切酶部分在前面肯定就有双酶切的Buffer推荐表。有些酶没有搭配的推荐，但是有各种酶在L，M，H，K及T+BSA的相对活性，AB两酶选一个合适的即可。注意尤 ...
〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓 2007年零应助帖/疑难帖集合〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓已应助帖不代表求助已经解决，鼓励战友继续积极应助，加分机会与尚未应助帖均等不规范贴不在此次整理范围，请大家规范发贴请大家在发帖前仔细阅读版规,细心搜索文献资料及丁香园内部后再发求助帖,以减少版主和其他热心战友的工作量.谢谢!1.【求助】T4 DNA Pol 补平http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9229803&sty=1&tpg=25&a ...
Re:cDNA文库构建问题http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=729416BAC文库构建完全手册,无私奉献!欢迎下载!!!http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=969664这是我们常用的建基因组文库的流程，与大家分享。如有不足，尚请指正！http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=895823cDNA文库建库流 ...
我来整理生物芯片方面的资料第一部分 基础知识制造基因芯片的公司http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=1824869&sty=3&keywords=%BB%F9%D2%F2%D0%BE%C6%AC介绍基因表达谱芯片的课件http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=73&id=1817417&sty=3&keywords=%BB%F9%D2%F2%D0%BE%C6%AChttp:/ ...
本人持有以下载体及基因：（原则上只交换不赠送，欢迎广大站友互通有无）QQ 2283524599 luckamily@126.com一、载体1)、miRNA载体Promega miRNA靶标克隆载体 psiCHECK-2 psiCHECK2 ampAmbion miRNA靶标克隆载体 pmiR-report pmiRreport ampInvitrogen miRNA过表达载体 PCDNA TM 6.2-GW/EmGFP-miR2)、哺乳动物/真核表达载体pcDNA3.1+ 不 ...
从质粒抽提谈起复旦大学生化与分子生物学实验室碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至 ...
第四节 病毒载体携带的siRNA介绍在大多数真核细胞，RNAi是一个高度保守的机制，它被认为是基因表达和抗病毒机制的调节剂。1-4 RNAi是一个多级的过程，第一步是:在一种核糖核酸酶Ⅲ样的酶(Dicer5 )的作用下，双链RNA(dsRNA)被裂解成小干扰RNA(siRNA)。6这些21到23个核苷酸的siRNA随后参与构成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，可以将siRNA带到同源mRNA的地方，并将其破坏。在2001年，E ...
外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两 ...
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