DNA基础知识

目的基因与载体的重组（重组体的构建）程序如下： （1）质粒DNA 的分离纯化。一般含有单个目的基因的DNA 片段，即使进入了宿主细胞也不能进行增殖。通常它需要同适当的能自我复制的DNA 分子（例如质粒、噬菌体DNA 等）结合后，才能在通过转化或其他途径导入宿主细胞，像正常质粒或病毒一样增殖和易于检测。分离质粒载体DNA 有许多方法，但其共同步骤是先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养物，以除去其细 ...

Amberg Lab Upstate Medical University http://www.upstate.edu/biochem/amberg/protocols/seq_temp.html Notes on DNA : The cleaner the better.If mini DNA use phenol extracted and use the entire mini pre ...

(adapted from Bruce A. Roe Department of Chemistry and Biochemistry The University of Oklahoma Norman Oklahoma 73019 broe@ou.edu) Restriction enzyme digestions are performed by incubating double-stran ...

随机扩增多态DNA (Random Amplified Polymorphic DNA ，简称RAPD)是J.Williams和J.Welsh两个研究小组于1990年同时提出的一种随机引物扩增，寻找多态DNA 片段的遗传标记技术，它是建立在PCR技术基础上，以随机的寡聚脱氧核苷酸作为PCR反应引物，对基因DNA 进行扩增而显示DNA 图谱和对物种进行亲缘关系、系统发育分子水平的鉴别，以及分子生物学 ...

试验准备： 1、LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5 加去离子水至总体积1升高压下蒸气灭菌20分钟。 2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉高压灭菌。 3、氨苄青霉素(Ampicillin Amp)母液：配成 50 ...

双元载体的农杆菌转化 1.1农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。 1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。 1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。 1.1.4. 转入无菌离心管，500 ...

Hi This is my first post and I am desparately looking for some help recovering DNA from CsCl preps. I have recently run into some problems precipitating DNA using sodium acetate (3M 1:30 dilution) and ...

Q: 怎样对合成DNA制品进行定量? A: DNA的量与260 nm处的吸光度值（OD值）成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的。1个OD值的合成DNA的重量约为33 mg。 Q: 怎样理解测定的OD值? A: 进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。当测定200 ml溶液中的OD值为1.5时，溶液整体的OD量应该为多少？此时的OD值 = 1.5 OD/ml &ti ...

Hi I have a 9kb fragment already cloned into bluescript and I am trying to insert an extra 3.5kb. I've been trying for some time now with no success - when I do get colonies very few have any of the n ...

原理： 此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。 单一引物与反向重复序列结合。 使重复序列之间的区域得以扩增。 引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶 ...

Amberg Lab Upstate Medical University http://www.upstate.edu/biochem/amberg/protocols/transformation.html 1.Grow cells to 1X10E8 or OD600 of 1.2-1.3. 2.Spin cells at 5000rpm for 5 min and wash pelle ...

一、目的与原理 当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。 二、材料和方法 1． 材料：大肠杆菌 2． 仪器： 离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜 3． 试剂 LB培养基，0.1M MgCl2，3mM氯化六氮合高钴 TFB ...

实验步骤： 1、将适合菌株（如XL1-Blue DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37℃下过夜培养 。 2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用 。 3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中 。 4、37℃下剧烈振荡培养2-6小时。 5、定时监 ...

实验目的 要获得表达的基因AKP，必须构建重组子。 我们通过以下的方法构建重组DNA，转入受体菌，就可以表达出目的基因。 之所以重组子要进入细胞，是因为大肠杆菌中有修饰的机制，可以在转入表达载体时不被降解，高效表达。 实验原理及过程 ...

1.PCR技术 PolymeraseChainReaction聚合酶链反应 它是一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四种dNTP的情况下，通过高温变性（90℃－95℃，1－2min）低温退火（25℃－37℃，1－2min）中温延伸（60℃－75℃，90sec-5min）这样反复循环的过程中，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。 1）、PCR反应 ...

DNA分子的体外连接就是在一定条件下， 由DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。 带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中，但是在连接反应时，外源DNA和质粒都可能发生环化，也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接 ...

常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域 ...

报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在， ...

分子诊断技术在检验医学的基础和临床研究中显示出强大的优势，例如，在乙型肝炎的诊断和治疗中，应用DNA定量技术为乙型肝炎的治疗和预后监测提供了重要依据，但近近不无症状乙型肝炎表面抗原携带者及乙型肝炎表面抗阴性者的人群中检出了前C终止密码子变异（G1896A）。研究表明，突变将导致乙型肝炎病毒继续复制，因此这一信息对于临床诊疗十分重要。又如庆大霉素等氨基糖苷类抗生素的毒副作用之一是诱发耳聋，且已证明线 ...

1.Take the 384 well viper plate from the thermocycler. Remove the Silicone Sealing Mat (Axygen Scientific: AM-384-PCR-RD) and place face down on a paper towel and pat to absorb any liquid that may be ...