免疫细胞与组织染色实验

1、现状与展望 免疫荧光组织化学技术经过半个多世纪的不断改进和创新，已成为现代研究生物和医学的重要手段之一。由于免疫荧光技术与形态、机能相结合不断完善和发展，尤其是合成了多种新荧光素与抗体容易结合，结合物稳定。可以和FITC结合进行免疫荧光组织化学双标记或三标记。至今，它已和亲合化学技术如SPA、Biotin以及avidin、ConA相结合，应用领域也日益扩大，又与现代的电子计算机和扫描电视技术， ...

1、荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具，分透谢和落射二种类型，落射光无需镜内操作方便，效果更好。它是由超高压光源、滤板系统（包括激发和压制滤板）和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。 2、荧光显微镜标本制作要求 （1）载玻片 载玻片厚度应在0.8-1.2 mm之间，太厚的玻片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在 ...

1、染色特异性和敏感性的测定方法 （1）特异性染色和效价测定 直接染色效价以倍比稀释荧光抗体溶液如1：2、1：4、1：8……，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+++”的最大稀释度，为其染色滴度(效价)或单位。实际染色应用时，可取低一个或两个稀释度(即2~4个单位)，如染色效价为1：64，实际应用时可取1：32或1：16。间接染色效价可按抗 ...

制备荧光抗体是免疫荧光组织化学的重要技术之一，制备特异性强和高效价的荧光抗体必须选用高质量的荧光素和高效价的抗体。 一、荧光素 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止。可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光色素。目前主要常用于标记抗体的荧光色素如下： 1、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC） FITC是一种呈黄色粉 ...

为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以下对照试验： 1、直接法 （1）标本自发荧光对照 标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称为自发荧光。 （2）抑制试验 可分为二步方法和一步方法。 一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗 ...

免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织 ...

一、免疫荧光组织（细胞）化学技术的发展简史 免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事(1941)建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞（或组织）化学。它与葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素与卵白素、植物血凝素（ConA等）相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器 ...

一、荧光素与抗体结合 1、透析法 （1）概述：适用于蛋白质含量低、样品体积小的抗体溶液的标记；标记较均匀，非特异荧光较低。 （2）步骤：将含10 mg/ml的Ig溶液10 ml装入透析袋；将上述透析袋放入烧杯中，含0.1 mg/ml FITC的pH=9.4的碳酸盐缓冲液100 ml；4 ℃磁力搅拌24 h；取出透析袋，进行纯化、鉴定。 2、搅拌法 （1）概述：适用于蛋白质含量较高、样品 ...

一、组织处理 恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。 1、组织及时取材和固定 ...

一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究 ...

二、缓冲液 免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。 1、0.2 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer，PB） 试剂： NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O。 配制方法：配制时，常先配制0.2 mol/L的NaH2PO4和0.2 mol/L ...

如何获取与组织细胞功能相关的各种定量测量信息是免疫组织（细胞）化学的一大难题。制作免疫组织（细胞）化学标本环节较多，只要有一个环节失误就会影响实验结果，除了需要精制的药品外，还需要熟练的技术。那么，做成理想的标本后，如何进行观察才能获得尽量多的的各种定量信息，而且使这些信息能较客观的反映出来，这就是本文的写作目的。 一、定量分析的重要性 目前有许多研究免疫组织（细胞）化学的文章，是做定性和定位研 ...

5、研究神经递质的超微结构定位 应用免疫电子显微镜技术（常用为PAP法或胶体金标记技术）可显示抗原在神经细胞内的超微结构定位及在突触水平神经元间的联系的化学本质。Pickel应用免疫电镜观察证明TH存在于DA和DA能神经元的细胞体、树突和近侧轴突。在胞体内此酶定位于内质网、Golgi器和微管上。神经终末枝的突触小泡一般认为是神经递质的亚细胞贮存部位，在电镜下观察神经末梢内突触小泡呈现不同形态，目前 ...

一、其它荧光抗体染色方法 1、膜抗原荧光抗体染色法 本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS即采用此法原理。 2、双重染色法 在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法： （1）一步法双染色　 先 ...

一、原理与意义 免疫荧光组织（细胞）化学染色方法——补体法，是一种荧光抗体染色法。本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。 二、操作指南 1、材料 （1）免疫血清60 ℃灭活20 min，用Kolmers ...

一、原理与意义 免疫荧光组织（细胞）化学染色方法——间接法，是一种荧光抗体染色法。该方法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。 二、操作流程 （一）双层法（Double Layer Method） 1、切片固定后用毛细滴管吸取经适 ...

一、原理与意义 免疫荧光组织（细胞）化学染色方法——直接法，是一种荧光抗体染色法。该方法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。 二、操作流程 1、染色：切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人Ig ...

免疫细胞化学的发展对许多领域的研究起到很大的推动作用，在神经科学的研究中尤为突出。本文仅就免疫细胞化学在神经科学的基础研究方面的应用做一简单介绍。 一、确定神经递质的性质、定性和分布 早期的神经科学工作者应用传统的神经解剖学研究方法如甲基蓝染色法、镀银染色法等对中枢及外周神经系统的结构做了大量的研究工作，但由于技术方法的限制，对神经递质的性质无法确定。1949年Koelle建立了胆碱酯酶染色法（ ...

抗原修复主要用于福尔马林或多聚甲醛固定的石蜡包埋组织切片。 1、抗原热修复 （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗 ...

免疫细胞化学技术在继续改进和完善中，新的技术方法不断出现。除目前国内已开始应用的免疫金技术和免疫金银技术外，80年代，新的免疫细胞化学技术还有半抗原交联抗体法和令人瞩目的分子杂交免疫细胞化学技术。免疫金银技术和分子杂交免疫细胞化学技术将分别以专章叙述，本节仅就半抗原交联抗体法作一简要介绍。 【半抗原交联抗体法（Hapten –Coupled techniques）】 近年来，为提高敏 ...