免疫细胞与组织染色实验

探针标记物 利用分子杂交的原理对待测核酸进行检测，必须将与待测核酸进行杂交反应的探针用某种可以检测的分子进行标记。探针的标记是指将一些可以用一定的方法显示或检测的物质，即标记物结合在探针上的过程。 理想的探针标记物应具备以下特性： ①高度灵敏性； ②与探针的结合不影响探针的主要理化特性、杂交特异性和杂交稳定性； ③显示或检测要简便、节时、准确可靠、重复性好； ...

原位杂交组织化学杂交反应 杂交反应是指用杂交液孵育组织切片，杂交液中标记的核酸探针在适当的条件下与组织细胞内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程。杂交液的成分与预杂交液基本相同，所不同的只是加入标记的核酸探针。 杂交前的准备只是为杂交成功奠定基础．要获得满意的实验结果，在杂交反应的实验过程中还必须注意以下环节。 (一)双链DNA探针和靶DNA变性 进行杂交反应时．探针和靶 ...

随机引物法探针标记 随机引物法的原理是使被称为随机引物(random primer)的长6个核苷酸的寡核苷酸片段与单链DNA或变性的双链DNA随机互补结合(退火)，以提供3，羟基端，在无5，→3，外切酶活性的DNA聚合酶大片段(如Klenow片段)作用下，在引物的3，羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物。当反应液中含有标记的核苷酸时，即形成标记的DNA探针。6个核苷酸混合物出现所有可能结合 ...

缺口平移法探针标记 探针的标记方法很多，大致可以分为两大类：引入法和化学修饰法。引入法是运用标记好的核苷酸来合成探针，即先将标记物与核苷酸结合，然后通过DNA聚合酶、RNA聚合酶及末端转移酶等将标记的核苷酸整合入DNA或RNA探针序列中去。化学修饰法即采用化学方法将标记物掺入已合成的探针分子中去，或改变探针原有的结构，使之产生特定的化学基团。引人法较化学修饰法更常用．按其整合的方法不同?引 ...

原位杂交组织化学对照实验 为证明原位杂交实验操作的准确性和实验结果的可靠性，必须设置一系列对照实验。对照实验的设置应根据核酸探针和靶核酸的种类以及现有的可能条件选定。一般应在下述几种对照实验中选择3～4种，以证实杂交结果的可信性。 (一)组织对照 1．Southern或Northern印迹反应 原位杂交能在组织细胞原位显示待测核酸(DNA或RNA)的存在。为了进一步证实原位 ...

原位杂交组织化学杂交体检测 杂交体检测又称杂交体显示，是指通过一定方法使杂交反应形成的杂交体(杂交信号)成为在显微镜下可识别的产物。对原位杂交反应信号进行显示的方法因探针标记物不同而异。 (一)放射性核素标记探针的检测 第一个原位杂交实验(1969年)以’H作为核酸探针的标记物，杂交信号用放射自显影术检测。随着原位杂交技术的推广和应用，32P、125I及35S等放射性核素均可用 ...

原位杂交组织化学杂交后处理 杂交后处理的目的是除去未参与杂交体形成的过剩探针，解除探针与组织标本之间的非特异性结合，包括那些与靶核酸相似的序列和探针之间形成的含非互补碱基对的杂交体，从而减低背景，以获得较高的信噪比。 杂交后处理主要包括系列不同浓度和不同温度盐溶液的漂洗。洗涤条件(盐浓度、温度、洗涤次数和时间)因核酸探针类型和标记物不同而略有差异，一般而言，盐浓度由高到低，而温度由 ...

双重和多重原位杂交技术 为了在同一标本上或同一细胞内同时检测是否存在两种或两种以上的靶核酸序列。可应用双重或多重原位杂交技术．即以两种或多种标记探针与靶核酸杂交。然后利用不同的检测手段分别显示各种靶核酸的存在和分布。该技术与免疫组织化学技术中的双重或多重标记相似，除了探针本身的特异性外，对结果的干扰主要来自标记物及检测试剂的互相影响。 （一）放射性核素和非放射性标记探针的双重标记原 ...

PCR扩增标记法探针标记 PCR扩增标记法的原理与普通的核酸PCR相同。即Taq DNA多聚酶以DNA为模板，在特异引物引导下，在PCR仪中合成cDNA探针。由于在反应体系中加入一定量的标记dNTP，因此扩增的同时又是一个标记过程。cDNA探针PCR扩增法标记原理末端标记法探针标记缺口平移法探针标记随机引物法探针标记探针标记物原位杂交组织化学杂交前处理原位杂交组织化学基本程序原位杂交组织化 ...

荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术(florescence in situ hybridization，FISH)是一种利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性及直观性和原位杂交的高特异性结合起来，通过荧光标记的核酸探针与待测样本核酸进行原位杂交。在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞和组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病 ...

原位杂交组织化学基本程序 根据所用探针的种类和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA－DNA杂交，DNA－RNA杂交和RNA－RNA杂交三类。因原位杂交多用于检测组织细胞内的mRNA及其表达，故DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交较多见，DNA-DNA杂交主要用于染色体原位杂交以对染色体中的DNA进行定位。 根据探针的标记物是否能直接检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。在直接法 ...

胚胎原位杂交技术 通过分析mRNA在不同发育时期组织中的表达变化，有助于了解胚胎发育的基因调控机制。原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方法，在发育生物学研究中起重要作用。胚胎原位杂交包括全胚胎原位杂交和胚胎组织切片原位杂交。 全胚胎原位杂交技术(whole mount in situ hybridization)可以从整体水平反映胚胎发育过程中基因表达的时空顺序，是一种广泛应用于胚胎 ...

原位杂交结台免疫组织化学技术 原位杂交结合免疫组织化学技术主要用于在同一细胞内同时或先后检测特定基因在核酸和蛋白质或多肽水平的表达，这样。不仅能了解基因表达，而且还能研究某种基因表达的翻译和转录调节。如果免疫组织化学检测的抗原成分是与原位杂交的靶核酸不同基因编码的蛋白质或多肽等，那么同时使用原位杂交和免疫组织化学技术可研究一种基因的转录与另一种基因编码的蛋白质合成之间的相互关系。在病毒学研 ...

原位杂交组织化学标本制备 (一)取材 用于原位杂交反应的组织应尽可能新鲜，因此要求取材迅速。由于很多RNA极易降解，取下的组织应尽可能迅速固定或冷冻。为了避免外源性RNA酶引起靶组织中RNA丢失，取材时应戴手套，所用的器械、容器都要经高压消毒，或清洁后用经焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)处理过的灭菌蒸馏水清洗。此外，避免用手直接接触组织、器械、容器和 ...

原位杂交组织化学杂交前处理 杂交前处理的目的在于提高组织通透性。增加靶核酸的可及性以及防止RNA或DNA探针与组织细胞或载玻片之间的非特异性结合，从而增强杂交信号，降低背景。杂交前处理的具体方法和步骤因所采用的固定剂、组织标本以及探针不同而异。用温和的非交联固定剂固定的细胞培养标本和冰冻切片，不需经特殊的杂交前处理，一般均能获得较好的杂交反应结果。而用交联固定剂固定的标本。尤其是福尔马林固 ...

常用电镜原位杂交技术的基本程序 原位杂交技术自创立以来，为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病理学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料，发挥了其他技术难以取代的作用。但不论是使用放射性核素探针，还是非放射性探针，大部分研究工作都还限于光镜水平。为了对检测的靶核酸进行更精确的亚细胞定位，以及能观察含靶核酸序列细胞的超微结构，人们便将原位杂交与电镜技术相 ...

免疫电镜技术组织的取材与固定 免疫电镜技术是根据抗原与抗体特异性结合的原理，利用高电子密度的标记物标记抗体或用经免疫组织化学反应能产生高电子密度产物的标记抗体，在超微结构水平对抗原进行定性、定位的技术方法。Singer于1959年首先建立了用电子密度较高的铁蛋白(ferritin)标记抗体的方法，可对细胞表面抗原进行超微结构定位。该技术为免疫电镜技术的发展奠定了基础。Nakane与Pier ...

电镜组织化学技术样品制备 良好的样品制备是电镜酶细胞化学技术成功的关键。酶电镜组织化学样品制备要求既要保存酶的活性，同时又要保存细胞的超微结构。并能防止酶反应产物扩散。每种酶对固定液的要求和显示方法虽不尽相同．但电镜酶组织化学的基本程序相似，下面简要介绍其基本要求： 1．取材 组织标本的取材是样品制备的第一步，非常重要?所以，取材前应做好计划和充分准备。原则上。目标要明确，操作要 ...

电镜原位杂交的特点 电镜原位杂交的原理和基本操作步骤与光镜水平的原位杂交相似，但电镜原位杂交不仅要求获得满意的杂交信号，而且还要求保持良好的超微结构。为了兼顾既保存较好的细胞超微结构又保证较好的杂交反应两者之间的关系，在电镜原位杂交中应注意以下几个特点： 1．选择合适的固定剂 所用固定剂最好为交联固定剂，如甲醛和戊二醛，既能良好保存细胞超微结构，又能有效地保存组织细胞中的核酸，尤 ...

电镜组织化学技术基本原理 电镜组织化学技术是在光镜组织化学基础上发展起来的形态学研究技术，它将组织化学与电镜技术相结合，使组织化学研究从光镜微细结构水平发展到电镜超微结构水平。电镜组织化学技术将组织细胞中特定的化学成分通过特定的化学反应形成反应产物，然后使其形成电镜下易于观察的高电子密度不溶性沉淀物，从而在超微结构水平对特定化学成分进行原位分析，由此将生物化学与超微结构有机联系起来，显示组 ...