免疫学技术

转录因子磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定 蛋白质可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。磷酸化反应是泛指把磷酸基团通过酶促反应转移到其他化合物的过程。蛋白质的磷酸化则是指由蛋白激酶(proteinkinase，PK)催化把ATP或GTP7位的磷酸基传移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白磷酸酶催化的，称为蛋白质的脱磷酸化。蛋白激酶催化 ...

免疫共沉淀技术 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的蛋白质―蛋白质间的结合被保持下来，因此可用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质―蛋白质相互作用。如果实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用，第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测；如果实验目的是发现新的结合蛋白，可以直接对胶上蛋白质进行染色来确定。其实验步骤如下。 (1)用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适 ...

染色质免疫沉淀分析(ChIP) ChIP是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法(图2―8)，也可用于分析与转录、有丝分裂或DNA损伤相关的发生改变的组蛋白修饰。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。该技术主要应用于：①组蛋白修饰研究；②转录调控分析；③药物开发研究；④有丝分裂研究；⑤DNA损失与 ...

基因调节元件的测绘和分析技术基因调节元件的测绘和分析(gene regulatory elements mappmg and analysis，GREMA)技术是由加州大学圣地亚哥分校(UCSD)付向东博士领导的研究小组发明的，并已经独家授权给ASB做商业开发。这一技术通过以下方法克服了第一代ChIP―Chip分析的限制。首先它不用免疫沉淀的DNA材料(仅以DNA作为寡核苷酸连接的模板) ...

染色质免疫沉淀芯片(Chip-Chip) NimbleGen是目前能提供定制ChIP―Chip服务的第一家公司。该技术能够快速在目标基因组的染色体中确定特异DNA结合蛋白的准确结合位点，ChIP芯片也可以在一个基因组的任何感兴趣的区域内寻找染色体的结构改变。 1．ChIP―Chip的用途 (1)在基因组范围内确定基因转录因子的DNA结合位点和其他DNA结合蛋白或蛋白复合体的DN ...

ArrayStar转录因子活性ELISA检测法 ArrayStarTM转录因子活性ELISA试剂盒可以快速、灵敏地检测细胞核提取物中转录因子的DNA结合活性。试剂盒采用96微孔板，标记探针是生物素标记的双链寡核甘酸片段，含有转录因子的特异性DNA结合序列。当标记探针与细胞核抽提物一起孵育时，核抽提物中活性形式的转录因子与探针特异性结合，形成转录因子／探针复合物。随后，转录因子／探针复合物与 ...

ChIP―GLAS启动子芯片 基因表达的研究或称mRNA水平分析，是要确定在任何细胞或组织中，一个或多个基因的开启或关闭(基因转录调节)程度，也是对基因在不同条件下和应对各种刺激下如何发挥作用的一种综合分析。DNA微阵列是系统性测定基因表达的关键技术。然而，当今科学家面临的主要困惑是，传统的DNA微阵列技术主要是检测基因转录产物mRNA，这样目前的DNA微阵列只能研究人基因组总DNA的1. ...

脂肪细胞发育分化的转录调控研究 脂肪细胞在分化过程中获得形态学表型(例如脂肪细胞内脂滴的聚集)的同时，在分子水平上也发生了各种基因的表达变化。根据对分化前、分化中和分化后的细胞抽提液的双向电泳分析结果，发现在开始分化的5h内，至少有100种以上的蛋白质表达情况发生了变化，其中就包含了重要的转录激活因子。在分化过程中有利于脂肪细胞分化或脂肪细胞所特有的蛋白质组分会随分化过程增加，抑制脂肪细胞 ...

转录因子活性芯片 真核基因的表达是由转录因子调控的。通过与存在于某些基因启动子上的特异DNA结合因子的相互作用，转录因子调节转录起始的频率。转录因子的表达或活性可以受细胞类型、组织特异性以及细胞周期的调节，这种调节也可以通过与其他蛋白质相互作用而实现。通过把这些调节机制的不同整合・，真核生物可以激发无数的基因表达模式。要充分了解基因表达是如何调节的，关键是对转录因子的DNA结合活性进行分析 ...

组蛋白修饰 组蛋白的某些赖氨酸能够发生单、双、三甲基化，精氨酸可发生单或双甲基化，其他修饰方式还有乙酰化、磷酸化、泛素化以及ADP化。它们的联合组成了组蛋白密码，并通过与其他蛋白的作用调控染色质组装和基因的表达。组蛋白修饰方式示意图注：P为磷酸化；A为乙酰化；M为甲基化 1．甲基化 组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶(histonemethyl transferase，HMT ...

表现遗传学中DNA的修饰――DNA甲基化 DNA甲基化是哺乳动物DNA最常见的复制后调节方式之一，是正常发育、分化所必需的，具有重要的生物学意义。 在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的作用下，以S―腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，可以将甲基基团转移到基因组DNA胞嘧啶第5位碳原子(C5)上。在哺乳动物中，C5的甲基化主要发生在CpG二核苷酸上 ...

组蛋白修饰和DNA甲基化之间的关系 在引起基因沉默的过程中，沉默信号(DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重新装配)是如何进行的?谁先谁后?这是一个“鸡和蛋”的问题，目前仍处于研究阶段，还没有定论。研究发现DNA甲基化和组蛋白乙酰化是一个相互促进、加强的过程，如许多HDAC可以和DNMTl、3a、3b相互作用；而甲基化CpG结合蛋白―2(methylcytosinebindingprotein ...

具有HAT活性的转录共激活因子 位于组蛋白附近具有HAT活性的激活因子可降低染色体结构的稳定性。酵母和四膜虫HAT的实验证明，组蛋白乙酰化在转录激活过程中起作用。酵母HATs(SAGA、NuA4、NuA3、Ada)和四膜虫NuA4可促进体外核小体转录。HAT的刺激转录作用只有在乙酰辅酶A存在时才可观察到。HAT通过几种机制刺激基因转录，由结合启动子的激活因子募集的HAT可导致局部组蛋白的乙 ...

表观遗传学中组蛋白的修饰 染色质是由DNA双链缠绕组蛋白和非组蛋白形成。基因表达的中心问题之一是，各种转录因子与RNA聚合酶是如何接近紧密包裹在染色质中DNA的。组蛋白乙酰化后，染色体处于开放状态而利于转录，并上调基因的表达。 组蛋白乙酰化是一个动态过程，乙酰化和去乙酰化处于动态平衡状态。催化组蛋白乙酰化的酶是组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyltransferases，H ...

表观遗传调控的原理和概念 表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变化而表型却发生了改变。换言之，这是一种DNA序列外的遗传方式。基因组含有两类遗传信息：一类是传统意义上的遗传信息，即DNA序列所提供的遗传信息；另一类是表观遗传学信息，它提供了何时、何地、以何种方式去应用遗传信息的指令。 现代研究发现，异常的表观遗传可能导致发生肿瘤、自身免疫病 ...

P16 p16于1976年初被发现，定位于9p21，全长8．5kb，有3个外显子和两个内含子，其基因产物为P16蛋白，相对分子质量为15 840，为148个氨基酸组成的单链多肽蛋白。p16是人类肿瘤中最常见的抑癌基因，是细胞周期蛋白激酶抑制剂。它通过结合并抑制细胞周期依赖的蛋白激酶CDK4和CDK6，导致Rb的磷酸化抑制来调控细胞通过G1期。在人乳腺上皮细胞(HMEC)中，p16基因CpG ...

RB蛋白相互作用相关因子(RIZl) RIZI是抑癌基因的一种，也是组蛋白甲基转移酶超家族成员。人类多种恶性肿瘤常有RIZI失活，其失活方式有mRNA表达缺失、移码突变、染色体缺失和错意突变。此外，RIZImRNA表达缺失亦与其启动子CpG岛甲基化有关。在44％的乳腺癌标本中发现，RIZImRNA的表达缺失或下降与RIZI启动子CpG岛甲基化有很大关系。在癌细胞中，甲基化酶抑制剂5―氮杂― ...

乳腺生长抑制因子(mammaryderivedgrowthinhibitor，MDGl) MDGI是一种脂肪酸结合蛋白，它特异地抑制乳腺上皮细胞的增殖，并使其向乳腺小泡的方向分化而促使乳汁分泌。尽管在乳腺肿瘤组织中并没有检测到MDGI的表达，但同源缺失及点突变却不是MDGI失活的重要机制。DNAEP迹法分析乳腺原发肿瘤表明，近一半样品的MDGI表达缺失与其基因的甲基化程度增加有关。 ...

DNA甲基化在肿瘤发生中的作用 越来越多的研究表明，在肿瘤形成过程中包含两大类机制。一个是通过DNA核苷酸序列改变而形成突变，即遗传学机制。肿瘤作为一种遗传学疾病在分子生物学领域已经得到证实。另外一个就是表观遗传学(epigenetics)机制，即不依赖DNA序列改变导致基因表达水平的变化，它在肿瘤形成过程中的作用越来越受到重视。遗传学与表观遗传学两种机制相互交叉存在，共同促进了肿瘤的形成 ...

14―3―3σ 14―3―3σ定位于lp35。14―3―3σ基因的功能主要是使DNA损伤后细胞周期停止于G2期。正常情况下，DNA损伤诱导14―3―3σ基因表达，并使细胞停止于G2期。但在原发性膀胱癌、结肠癌、乳腺癌中14―3―3σ基因的表达下调。对这种表达下调的分子机制研究表明，其原因主要是14―3―3σ基因第一外显子区的高甲基化，而不是杂和型缺失、基因突变等。用亚硫酸钠处理基因组测序， ...