免疫学技术

顺式作用元件启动子 启动子是一段特定的直接与RNA聚合酶及转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA序列。真核启动子不像原核启动子那样有明显共同一致的序列，一般包括转录起始点及其上游100～200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件长7～30bp。不同的启动子对RNA聚合酶的亲和力不同，所结合的反式作用因子(transactingfactors)也不同，因此，基因转 ...

基因转录激活调节基本要素 普遍认为，真核基因的表达调控主要有3种形式： ①结构基因的内部或其附近存在对基因表达起调控作用的DNA序列； ②基因中某段富含CG序列的甲基化对基因表达起调控作用； ③通过染色体结构的变化控制基因的表达。 一般认为，在真核细胞结构基因的上游有一个启动区(由增强子、启动子、TATA框组成)，其下游由外显子和内含子组成。真核基因转录 ...

顺式作用元件增强子 增强子是远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关，可位于转录起始点的上游或下游。从功能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用。 增强子最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录效率提高100倍，其后在多种真核生物， ...

DNA―蛋白质、蛋白质―蛋白质相互作用 DNA―蛋白质相互作用指反式作用因子与／顷式作用元件之间的特异识别及结合，这种结合通常是非共价结合。 绝大多数调节蛋白结合DNA前需通过蛋白质―蛋白质相互作用形成二聚体或多聚体。由同种分子形成的二聚体称同二聚体，由异种分子形成的二聚体称异二聚体。除二聚化或多聚化反应，还有一些调节蛋白不能直接结合DNA，而是通过蛋白质―蛋白质相互作用间接结合D ...

碱性亮氨酸拉链(bZIP) 碱性亮氨酸拉链(basicleucinezipper，bZIP)：该结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有1个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在。螺旋的同一个方向出现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，该二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结 ...

锌指(zincfinger) 锌指(zincfinger)：每个重复的指状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。整个蛋白质分子可有2―9个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸人DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸。例如与GC框结合的转录因子SP―1中就有连续的3个锌指重复结构蛋白质的锌指结构 真核基因转录调控真核基因的转录与染色质的结 ...

反式作用因子的作用特点和规律 (1)一种反式因子能与一种以上的顺式元件结合：真核生物的转录因子不像原核生物的调控蛋白与顺式调控元件的结合有高度的专一性，有些反式因子可以和同源性很小的顺式元件结合。 (2)一种顺式元件能和一种以上的反式因子结合：与CAAT框结合的反式因子有好几类，如CTF类反式因子、CAAT结合蛋白(CP)类反式因子等。多种反式因子识别同一顺式元件，能加强这些反式因 ...

启动子功能性分析的方法 对基因启动子的瞬时转染分析研究必须经过下列步骤：①确定需要转染的细胞系；②鉴定目的基因的假定启动子区域；③选择报告基因和相应的报告基因分析方法；④将启动子插入到合适载体的报告基因上游；⑤选择合适的转染方法。 1．确定需要转染的细胞系 用于瞬时转染分析的细胞必须具备以下条件：①细胞应表达含有目的启动子的内源基因；②必须具备将质粒DNA转染人细胞的方法；③ ...

常见的报告基因 报告基因必须具备的特点：①由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；②细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测；③报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高，而且重现性好。到目前为止，报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连，先让质粒在大肠杆菌中进行增殖，再提取质粒，转染人感兴趣的真核细胞中。与此同时还要将有真核启动子和增强 ...

报告基因载体 (1)报告基因载体的特点：除了具有表达蛋白质所需要的结构外，理想的报告基因载体本身无调节结合位点或序列，而具有有意插入的调节结合位点，尽管可以从报告基因载体除去已知的结合位点，减少报告基因上游的转录，但从几千kb的DNA中去除所有潜在的调控序列是不可能的。因此在使用报告基因载体时，应使用合适的对照载体。报告基因质粒载体一般在大肠杆菌中繁殖，因此包括一个DNA复制起始点(ori ...

凝胶迁移滞留试验法 EMSA是近年发展起来的研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白质结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。EMSA基本原理示意图 ...

鉴定调控区的顺式作用元件 研究反式作用因子之前，一般应先鉴定并分析调控区的顺式作用元件，因为与调控区发生功能性相互作用的蛋白质难以鉴定。只有在体内，与调控区相结合的蛋白质才能发生与其他所需蛋白质的协同作用，该蛋白质的真正功能才能表现出来。所以对于调控区内功能相关性的DNA元件分析，将有利于鉴定功能性相关的DNA结合蛋白，并可进一步说明与DNA相结合的转录因子对基因调控的重要性。对重要序列元 ...

转录因子活性ELISA 转录因子活性ELISA是建立在ELISA基础上的高灵敏度的检测方法，比EMSA的灵敏度高l0倍，在5h内就能完成。不涉及放射性和凝胶电泳，安全简便，而且这种微孔板的形式能同时检测1―96个样品。ArrayStarTM转录因子活性ELISA试剂盒可以快速、灵敏地检测细胞核提取物中转录因子的DNA结合活性。试剂盒采用96微孔板的形式，标记探针是生物素标记的双链寡核甘酸片 ...

鉴定与顺式作用元件相互作用的转录因子 对启动子DNA结合蛋白的研究方法可分为两类： ①细胞内方法，以已知启动子DNA序列筛选出与其相结合的蛋白编码基因，通过生物信息分析来确定该蛋白质的名称。由于是细胞内筛选，因此更符合生理状态，且操作简便，适合大通量筛选，用于寻找未知基因及蛋白质。不足之处有两个方面：一是只能筛选可与启动子DNA特异性结合的蛋白质(如为筛选蛋白质已足够了)，但不能检 ...

DNase I足迹试验 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。 DNase I足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱 ...

酵母单杂交技术 1．酵母单杂交的基本原理 酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA―bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母G ...

实用DNA突变技术(一)PCR法扩增启动子5’端系列缺失突变体 采用PCR方法从基因组中扩增目的基因的全长启动子，在所扩增的片段两端分别引入限制性内切酶位点，以用于构建pGL3 basic报告基因表达质粒载体。同样采用PCR方法，以目的基因全长启动子报告基因表达质粒为模板分别扩增目的基因启动子5’端系列缺失突变体，这样就可以构建5’端系列缺失目的基因的缺失突变体。连续PCR引入突变位( ...

转录因子结构域的鉴定 所有转录因子至少包括两个结构域，即DNA结合域和转录激活域。此外，很多转录因子还包含一个介导蛋白质―蛋白质相互作用的结构域，最常见的是二聚化结构域。对于这些执行特定功能的结构域的研究也非常重要。对于调节因子功能结构域的鉴定，将有利于更好的了解转录因子的作用机制，并可以为操纵基因的表达提供更丰富的理论依据，以达到实验或治疗目的。 对于蛋白质来说，可以利用缺矢突变 ...

免疫共沉淀／免疫印迹检测组蛋白 可以用组蛋白抗体，进行免疫印迹检测沉淀下来的组蛋白，PCR方法扩增结合到免疫沉淀下来组蛋白上的DNA。 (1)新鲜准备洗脱液(1％SDS，0．1mol／LNaHC03)。 (2)加入洗脱液250／A1洗脱所得到的琼脂糖／抗体／组蛋白复合物，短暂蜗旋，室温震荡孵育15rain，将琼脂糖离心沉淀下来，上清液转入另一离心管中，再洗脱一次，将两次洗脱 ...

酵母双杂交实验技币和其他双成分系统 酵母双杂交系统是以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础。真核细胞转录激活因子的结构都基本相似，由一个DNA结合结构域(BD)和一个转录激活结构域(AD)组成，如酵母蛋白GAL4，这两个结构域相互独立但功能上有相互依赖，它们之间只有通过某种方式结合在一起才有完整的转录激活因子活性。根据这一特点建立了酵母双杂交系统。具体实验步骤如下。 1．第一 ...