免疫学技术

荧光抗体的质量鉴定与保存 荧光抗体的质量通常用抗体效价和结合比率（F/P比值）来表示。1、抗体效价：一般用琼脂双向扩散法测定。中央孔内加抗原（1 mg/ml），抗体稀释度在1:16-1:32呈阳性者较为理想。2、荧光素（F）与蛋白质（P）结合比率（F/P比值）法 F/P比值系指荧光素与抗体蛋白的克分子比值，是标记抗体质量鉴定的重要指标之一。该比值以1-2（抗球蛋白荧光抗体）或略高于2（ ...

细胞表面抗原的检测-间接免疫荧光法【试剂】（1）一抗和荧光标记的二抗（2）固定液：如4%多聚甲醛、乙醇等。（3）洗涤液及抗体稀释液(pH 7.4 PBS-Tween 20)【操作方法】（1）取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片（石蜡或冰冻切片）；（2）加入25ml一抗，完全盖住盖玻片，室温孵育60min；注意不可使盖玻片接触培养板孔边缘。每个检测应包括3组对照：与一抗同一种属、类型 ...

经典的荧光抗体技术基本原理(1)直接法直接法是荧光抗体技术最简单、最基本的方法。它通过标记抗体直接与相应抗原（待检抗原标本）结合，来鉴定未知抗原。其优点为：①由于在反应中只有两种因子参与，结果判断较简单；②特异性强，与其他抗原交叉染色较少；③操作步骤少，方法简便、省时。其缺点有；①敏感性较差；②一种标记抗体只能鉴定一种抗原；③不能用于鉴定未知抗体。(2)间接法间接法是目前最常用的方法。首先用已 ...

细胞内抗原的检测-间接免疫荧光法 细胞内抗原的检测过程与细胞表面抗原检测过程基本一致，只是在与一抗孵育前，需要预先对细胞用非离子去污剂进行透化处理。【操作方法】（1）取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片（石蜡或冰冻切片）；（2）用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min（室温），有些标本可能需要长达15min，时间视抗原而定；（3）余下步 ...

荧光偏振免疫分析（以环孢霉素检测为例）【基本原理】 荧光偏振免疫分析（FPIA）是一种利用物质分子在溶液中旋转速度与分子量大小呈反比的特点，定量检测抗原或抗体的一种分析方法。Ag或荧光标记的Ag（AgF）旋转比Ag-Ab或AgF-Ab复合物快，当接受一个偏振光面的投入时，如AgF分子的长轴与投入的偏振光面平行，荧光物吸收的偏振光最多，分子呈激发态，当回到基态时发射一个偏振光。如果反应液中的 ...

时间分辨荧光免疫分析（以血清中T3和T4检测为例） 时间分辨荧光免疫分析（time resolved luoro-immunoassay，TrFIA）技术出现于20世纪80年代初期，是在免疫荧光分析的基础上发展的一种新型超微量物质免疫分析方法。TrFIA采用镧系稀土元素标记抗体，利用荧光发射体的荧光寿命差别将波长相同的荧光分开，排除样品中的非特异荧光的干扰，从而最大限度地提高分析方法的灵敏 ...

酶-抗酶复合物的制备 1970年Sternberger等首先报道PAP法，也称为非标记抗体酶法（unlabelled antibody enzyme method）。此法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的改变和损伤，从而可使免疫酶法的灵敏度大为提高，常用于ELISA和免疫组织化学染色。 PAP制备的基本原理：抗体与相应抗原在一定条件下发生沉淀反应，但当抗原过量 ...

酶标抗体和酶-抗酶复合物的应用于细胞ELISA 应用酶标抗体进行免疫测定的方法较多，非均相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类酶免疫检测技术，其中以酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）最常用，它可用于测定抗体，也可测定可溶性抗原及细胞抗原。而酶-抗酶复合物多用于免疫组织化学。以下着重介绍ELISA（包括双抗体夹心法、细胞ELISA和 ...

酶标抗体的制备试剂及配制（1）辣根过氧化物酶（HRP）（2）抗体：要求见上节“荧光抗体的制备”（3）交联剂：戊二醛，过碘酸钠（4）0.05mol/L， PH9.5碳酸盐缓冲液(CBS) NaHCO3 2.94g Na2CO3 1.59g 蒸馏水加至 1000ml（5）1.0mol/L， pH9.5 ...

戊二醛二步交联法制备酶标抗体 戊二醛（glutaraldehyde，GA）：是一种常用的同型双功能交联剂，它的两个醛基可分别与HRP和抗体蛋白的氨基形成Schiff碱（-N=C-），将他们以五碳桥连接起来。戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一。可在4-40℃范围，pH6.0-8.0的缓冲液中进行。另外，GA缩合体使被结合的蛋白分子与分子之间的间隔延长，可免于使蛋白分子的三级结构发生改变。 ...

改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体 HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成Schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠还原成稳定的结合物。(1) 取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸盐缓冲液1ml中，加入1%DNFB无 ...

核苷和核苷酸的标记〔γ-32P〕-ATP标记 基因工程已广泛应用于医学诊断、重组新的分子、物种和品系。32P-核苷酸类在基因工程研究中不可缺少的核素标记的化合物。制备这类标记化合物的方法有化学合成法、化学酶促合成法和酶促合成法等。其中常用酶促合成法最常用，其优点是需要设备少，操作简便，时间短，易防护，标记物的放射性比活度高，能够满足基因工程中进行DNA标记及分子杂交等工作要求。【基本原 ...

酶标抗体和酶-抗酶复合物的应用于免疫酶组化技术（APAAP法）【基本原理】 碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法(APAAP法)，是一种免疫组化技术。用兔抗鼠IgG起搭桥作用，其中一个Fab段连接McAb ，另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的存在。该方法由于使用免疫桥联技术，故其敏感性高，结果易于判断，同时又减少了内源性酶的影 ...

蛋白质、多肽的放射性核素（125I）的标记氯胺T法（ch-T法）【基本原理】反应原理不清楚，仅仅是建立在实验基础上，有的学者认为当氯胺T溶于水后释放出次氯酸，将I~F离子氧化成I2、I~D，在pH为7.0-8.0条件下与蛋白质酪氨酸残基上邻位氢原子发生置换反应，形成放射性碘标记化合物，用偏重亚硫酸钠终止氧化反应，经过分离纯化，获得纯的标记化合物。【试剂及材料】（1）0.05mol/L和0.1m ...

免疫金标记技术 胶体金（colloidal gold）是氯金酸（chloroauric acid）的水溶液，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性核素和酶之后，在免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪剂。1971年，Faulk和taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究，随着技术的不断改进和完善，免疫金标记术已建立了免疫转印、流式细胞 ...

胶体金的制备 胶体金是氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。根据实验需要，可以利用不同的还原剂制备成直径大小不同的胶体金颗粒。（一）白磷还原法【试剂及材料】（1）HAuCl4水溶液（2）0.2mol/L K2CO3（3）白磷乙醚饱和液：在水中将白磷切成小片，用镊子快速取出，在滤纸上吸干后，放入小瓶，迅速加入10ml纯乙醚，塞紧瓶口，轻轻摇动至少2h，使乙醚充 ...

彩色免疫金银染色法【基本原理】 彩色免疫金银染色法是抗原位点处生成的银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂反应被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色还原剂由无色变为有色的染料并沉积在银颗粒部位，金属银变成银离子。【试剂及材料】（1）Lugol’s碘液（2）含5%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠溶液（3）2%铁氰化钾和1%溴化钾溶液（4）其余试剂同上【 ...

受体的放射配体结合分析技术 受体是存在于细胞表面、胞浆或细胞核内的生物活性物质，其功能是和细胞外的信息分子（配体）特异性结合，将信息转变为生物效应。受体现已可从细胞或组织中分离、提取，进行定量和定位分析。放射受体分析（radioreceptor assay，RRA）或受体的放射配体结合分析（radioligand binding assay，RBA）是建立在放射性标记配体与受体之间的结合反 ...

免疫金银染色法是利用银显影液，胶体金颗粒起着液化作用，使显影液中的银离子在还原剂（对苯二酚）存在情况下被还原成银原子，在金颗粒周围形成一个“银壳”，由于金颗粒的液化作用，使更多的银离子被还原，“银壳”增大，最后使抗原位置得以放大。【试剂及材料】（1）0．5%胰蛋白酶或胃蛋白酶：用0.05mol/L ...

免疫放射分析技术（用核素标记的抗体检测抗原） 1968年Miles和Hales建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法，为了与放射免疫分析区别，故称免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）。由于它应用核素标记抗体作为示踪剂，在反应体系中加入过量的抗体，待测抗原（或标准品）与和核素标记抗体进行全量反应，故亦称非竞争性免疫分析法。IRMA与RIA相比较有 ...