生物化学技术

蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案。虽然经过漫长岁月的进化，自然界已经筛选出了数量众多、种类各异的蛋白质，但天然蛋白质只是在自然条件下才能起到最佳功能，在人造条件下往往就不行，例如工业生产中常见的高温高压条件。因而需要对蛋白质进行改造，使其能够在特定条件下起到特定的功能。蛋白质的分子设计又可按照改造部位的多寡分为三类：第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；第二类为 ...

（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶 ...

（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。 ...

1. 用 Trypsin 酶解蛋白质时，碳酸氢氨的浓度应该是多少？ 酶解时碳酸氢氨的浓度一般在 10 ～ 50 mM 之间。碳酸氢氨的作用主要是提供一个碱性的水解环境，因为 Typsin 的活力在 pH8 ～ 9 之间最高。最常用的碳酸氢氨浓度有 20 mM ， 40 mM 。盐浓度过大时，后续的冻干过程中会有较多的盐析出；盐浓度过小时，则不能有效的提供碱性 pH 的水解环境（尤其是在样品的 pH ...

1. 怎样邮寄我的样品？ 冻干的胶或干粉可以直接邮寄。切胶后的湿胶（不用做任何处理），放在 EP 管中 ( 不加任何缓冲液 ) ；用干冰速冻；邮寄时，置样品于足够的干冰中。液体样品的邮寄方式同湿胶一样。 2. 为什么要使用内标？ 用内标做校准可以大大减少 MALDI-MS 的误差（ 3. 我为什么还要提供正负空白胶正对照提供 (exact) 对照两块胶？正负对照的两块胶是用来对整个鉴定过程做质量控 ...

1． 通过相似序列的数据库比对确定功能具有相似性序列的蛋白质具有相似的功能。因此，最可靠的确定蛋白质功能的方法是进行数据库的相似性搜索。需要明确的是，一个显著的匹配应至少有25%的相同序列和超过80个氨基酸的区段。对于不少种类的数据库搜索工具，快速搜索工具（如BLASTP）速度快，也很容易发现匹配良好的序列，一般就没必要运行更花时间的工具（如FASTA、BLITZ）；但当BLASTP不能发现显著的 ...

组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交，而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示按规定序 ...

1、吸附杂交 （1）HAP吸附杂交，羟基磷灰石层析或吸附是液相杂交中最早使用的方法，在液相中杂交后，DNA：DNA杂交双链在低盐条件可特异地吸附到HAP上，通过离心使吸附有核酸双链HAP沉淀，再用缓冲液离心漂洗几次HAP，然后将HAP置于计数器上进行放射性计数。 （2）亲和吸附杂交：生物素标记DNA探针与溶液中过量的靶RNA杂交，杂交物吸附到酰化亲和素包被的固相支持物（如小球）上，用特异性抗DNA ...

菌落原位杂交（colony in situ hybridization）。是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。 实验步骤如下： ①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。 ...

斑点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。 ...

采用RNA变性电泳法检测RNA质量方法如下:⑴ 凝胶制备：制备1.2%琼脂糖凝胶（电泳槽体积为50ml）① 称取0.6g琼脂糖，加入43.5ml水，加热溶解并降温到60℃。② 加入5ml 10×甲醛变性电泳缓冲液，并加入1.5ml 37%的甲醛，混合均匀。③ 倒入电泳槽中制胶（甲醛有毒，制胶应在通风橱中进行）。⑵ RNA模板准备（5~7.5μg total RNA）① 制备如下混合液 （9.7μl ...

通过体外无细胞系统翻译找出目的基因mRNA以后，变可进行cDNA第一链的合成，其步骤包括：1）在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg），100m mol/L甲基氢氧化汞1μl，室温反应l0分钟，使RNA变性。2)加100m mol/L的β-巯基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制剂2μl，室温放置5分钟。β-巯基乙醇有稳定 ...

1)离心沉淀cDNA第一链，并重悬在50μl水中，加50μl 2×第二链缓冲液(0.2mol／L Hepes，pH6.9，20m mol／L MgCl2，5 m mol／L DTT，0.14 mol／L KCl，1 m mol／L 4种Dntp)，混合均匀。2)每微克底物加大肠杆菌DNA聚合酶K1enow片段20～50单位，15℃反应20小时，此酶能识别cDNA 3’末端发卡环，并以其为引物，cD ...

遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，Pichia，植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母、果蝇、灵 ...

异源蛋白质在细菌中表达是目前使用的主要的蛋白生产系统。大肠杆菌一直是最经济的系统之一。然而为了生产需要特异修饰、胞外分泌或有特异折叠需要的蛋白质，其他表达系统也是需要的。真核细胞在表达原核来源的基因、真核基因的cDNA拷贝或其他无内含子的基因时可能表现很多特异问题。富含AT的基因在很多真核细胞中表达时会遭遇很剧烈的障碍。主要的真核信号序列如 加poly-A的位点、酵母转录终止位点和真核mRNA去稳 ...

类型I已知基因的序列（1）已知DNA序列，包括三种情况，一是已知目的基因的DNA全部或部分DNA序列（与题目要求略有出入）；二是已知其它物种的同类基因的DNA序列（功能可能已知，与题目要求略有出入）；三是已知目的基因cDNA全部或部分序列（属于题目要求已达到的类型）。（2）已知目的基因表达产物蛋白等序列。在这两种情况下一般采用PCR技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。类型II已有基因图位或标记 ...

使用法玛西亚公司的DNA/RNA浓度测定仪，测定样品A260和A280值。根据A260/ A280比值，估测RNA质量。一般A260/ A280比值在1.8~2.0之间，可以满足实验要求。在100μl RNA原液中取1μl稀释至250μl（DEPC处理的水），测定样品的A260和A280的值，按下列公式计算其浓度：RNA原液浓度=A260×稀释倍数×40（ng/μl）测定 RNA浓度按以下步骤进行 ...

扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通过构建扣除文库(subtractive library)得以实现的。差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有效的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂交的筛选效率，一种切实 ...

代表性差示分析（RAD）充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过消减和富集，使得目的基因片段得到特异性扩增。将待测cDNA (Tester)和驱动cDNA (Driver)分别用同一种识别4碱基序列的限制性内切酶切割，形成的平均长度为256bp的cDNA片段代表群，保证了绝大多数遗传信息均能被ＰＣＲ扩增；分别接上寡聚核苷酸接头(adaptor)，并以接头为引物进 ...

交互扣除ＲＮＡ差别显示技术（RSDD）是由Kang等于1998年最新提出的结合扣除杂交和ＲＮＡ差别显示两项技术发展而出的一种有效、快速分离差别表达基因序列的方法。该方法应用于肿瘤进展的研究，可鉴定和克隆已知的和高比率(65%)的未知序列，这包括分别作为增强和抑制表达进展功能的cDNAs，分别称为增强进展基因（PEGen）和抑制进展基因（PSGen）。1999年通过交互扣除RNA差别显示技术已鉴定出 ...