蛋白质技术

创建条带：在上一期，我们已经识别和分析了电泳图片的泳道，下面我们开始研究电泳条带的问题。首先在这里明确两个名词翻译：“Lane”指电泳泳道；“Band”指电泳条带（在下文中一律使用这两个英文名词来表示这两个意思）。a.电泳条带的识别：和前面研究Lane一样，首先我们要对Lane上的Band进行识别。识别方式同样分为自动识别和人工识别。自动识别的时候选择“Band-Detect Bands...”命令。这时Quantity One ...

10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片.（3）现用现配，配好后4度避光保存。11、如何才能充分脱蜡？（1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、 ...

如何正确使用Quantiy One定量：（以下文字系摘录+改写整合）WB做完，有时候我们需要对结果进行定量。目前最备受推崇的应该非Biorad公司的Quantiy One软件莫属，然而其$6K左右的售价令很多人望而却步；不过，这款软件之所以敢如此漫天要价，其最大的优点莫过于自动识别条带代替人工分析以降低主观误差，同时它的很多功能渗透了艰深的数理理论以及概率统计的原理，这在其它各类免费的随机附送的蛋白定量软件上是乏善可 ...

Stirpping：完整的WB流程结束后，可能需要重新标记某些膜，这时候就“可能”需要对膜stripping。这里用了“可能”二字，即不一定必须，那么首先讨论一下stripping的必要性。Stripping排除其他的不讲，整个流程会耗费不少的时间，从节约时间的角度来讲能不做最好；并且stripping条件过于激烈或多轮洗脱时，还会剥离已转印到膜表面的抗原使WB的最终信号削弱；此外，stripping buffer未 ...

Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，不同的是其采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽的类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗起反应，并经过底物显色检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

凝胶层析原理：视频本视频来自

教你怎么读电泳结果：视频本视频来自

显影--淬灭的祸因当抗体孵育、TBST漂洗结束后，进入ECL显影步骤。当然，目前国内一些实验室已经换用仪器扫描荧光信号，而我们更是二抗直接连荧光蛋白连ECL和常规的底片显影都省略了，因此以下所讨论的某些细节问题可能不再出现。首先坛子上还有少数实验室处于DAB显色时代，奉劝一句，都走到最后一步了就不要节省了；DAB显色的灵敏性是远远不够的。目前较为流行的仍是化学发光法，下面简述一下其原理：交联在二抗上的HRP酶能 ...

那么如何通过改变抗体稀释液的配方，寻求抗体孵育的最佳条件呢？首先要认清，抗体稀释液没有一个绝对通用的配方；一种抗体一个脾气。其次，抗体稀释液的配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原的强度，以及对其他区域的封闭强度两方面的平衡。目前，抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的样子 。。。可是，你有没有考虑过“复方”？--这下配方无限多了吧。1. 采用milk，BSA和gelatin的单方。3% milk，5% ...

抗体孵育：进阶篇：首先，抗原抗体识别原理的物理学解释，抗体孵育过程实际上就是一个竞争结合的动力学过程。由于抗原和抗体特异性结合的效率是非特异性结合的数百万--数十亿倍，所以当特异性抗体与非特异性'抗体'（不好描述，指添加在抗体稀释液中的封闭蛋白，我们可以把它们看成非特异性的一抗）竞争时，尽管抗体稀释液中封闭蛋白的浓度是一抗浓度20K：1以上，在碰撞几率相同的条件下，由于时间的积累加孵育过程中反复漂洗（孵育抗体要摇晃， ...

多肽是由复杂分子组成的化合物，每一条序列都有其独特的化学和物理属性。除了有些多肽难于合成，大多数多肽相对容易合成，但是纯化可能较困难。很多肽水溶性较差，因此在纯化时，这些疏水性多肽常常需要溶解在有机溶剂或者特定的缓冲溶液中。这些有机溶剂或者缓冲溶液有时并不适合生物学等方面的实验，所以客户就不能用这些多肽进行研究工作。因此，当接到多肽的订单时，我们会对这些多肽序列进行分析，以确定是否难以合成或水溶性的问题。针对一 ...

抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。封闭最短可以缩减到5min：很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说 ...

抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。封闭最短可以缩减到5min：很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说 ...

SDS-PAGE_的准备流程超详细：SDS-PAGE_的准备流程视频本视频来自youtube

转印——转印效率对WB结果的影响并不如书本和网络上宣扬的那么大！首先必须澄清的是，很多时候新手会把WB结果无信号归咎于转膜不够充分，实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高，真正取决定性因素的是抗体识别能力的强弱，以及如何正确使用抗体，这个问题下节讨论。有一个简单的例证，Biorad提供的3mm厚滤纸初次使用时，通常转膜效果不理想（从预染的marker深浅可知），但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响（建 ...

蛋白电泳：电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。经验之谈，8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的影响都问题不大（300KDa蛋白如何，没有尝试过）。电泳一般采用恒流，45mA-55mA（应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；此条件适合g ...

一、样品制备：1、变性条件——SDS LB直接裂解：用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB久煮某些性质会改变）的undefinedSDS LB（或者略高1.undefined）直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDS LB都是过量的（因此不一定要严格参考SDS LB稀释比）；如果SDS LB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘 ...

研究信号通路时，特别是对于高通量样本检测，通过传统的WB方法来检测蛋白是一项非常费时费力的工作。为了解决这个问题，科学家开始尝试一种新的方法，希望更加高效，简单，没有任何辐射的来检测这些蛋白，尤其是信号传导研究中的磷酸化蛋白。Cell Based Elisa 提供了这样一种理想的，高效的，直接的检测大量样本的细胞信号通路蛋白的方法。我们通过了解Cell Based Elisa 的实验步骤来解析怎样检测高通量的样本中的蛋白，尤其是信号 ...

蛋白质的提取工作是将经过处理或破碎的细胞，置于一定的条件和溶液中，让被提取物充分释放出来的过程。影响提取的因素主要是被提取物质在提取的溶液中溶解度的大小及由固相扩散到液相的难易程度。某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂理化性质有关，一般遵守“相似相溶”的原则。扩散作用对蛋白质的提取有一定的影响。减小溶剂的黏度、搅拌和延长提取时间可以提高扩散速度，增加提取效果，提取的原则是“少量多次”，即对于等量的 ...

在体外将两个或多个来源相同或不相同的DNA片段连接成新的重组DNA分子，再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。DNA重组技术的基本程序包括：（1）获得外源DNA：外源DNA是进行DNA重组的目的DNA片段，一般采用DNA聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-DNA聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因组文库或cDNA文库筛选等方法获得。（2）载体的构建或选择：分子生物学中用的载体是指能在特定 ...