蛋白质技术

现状基于腺相关病毒（AAV）的各种血清型载体被公认在人类基因治疗和基因疫苗接种应用中具有高潜力。在制造AAV载体期间，不必要的，不完全的颗粒共同产生。它们缺乏重组病毒基因组，仅由空衣壳蛋白组成。空衣壳增加了用于医学应用的AAV病毒的所需剂量，并且被认为引起针对载体衣壳的免疫反应，导致不必要的副作用。因此，在制造过程中去除空衣壳以及量化制剂中空AAV颗粒含量的能力是任何AAV生产过程的关键要求。 ❀制备AAV载体的 ...

基因治疗是目前生物医药领域热门的话题之一，生物医药行业对基因治疗持续高涨的热情，令该领域许多公司开始将一次治愈性基因疗法，作为其开发的战略核心。 有行业报告显示，未来预计 6 年内，将有多达 60 种基因疗法获得批准，这些基因疗法在 2024 年的销售额将达到 146 亿美元。 基因治疗的核心是基因载体，病毒载体占据着绝对主导地位。目前腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）是临床上广泛使用的病毒载体。 从 2012 年荷兰 UniQure 公司的，世界上A AV 基因治疗药物 Glyb ...

分子筛（SEC）无疑是众多层析方法中最娇贵的存在。要想获得满意的实验结果，一个高分辨高性能的柱子是必不可少的。刚接触层析的小伙伴们，接过这娇贵的柱子，是否不觉有种心跳加速，无从下手的感觉？这么娇贵的柱子，要怎么维护？不用担心，让我们一起了解学习一下吧~首次使用建议：在连接层析柱前，请务必务必务必确认流路中没有空气！一般柱子都是保存在20%乙醇溶液中，以避免微生物的繁殖，但是20%乙醇的粘度高于水溶液，因此，需要降低流速 ...

今天为大家带来镍柱的保养和清洗建议。Ni柱的使用与保养1. 对于一般的预装柱（Crude系列除外），上样前，样品需要使用0.22μm/0.45μm滤膜进行过滤或者离心处理，以避免样品中有细胞碎片等固体物质，堵塞柱子。2. 如果细胞裂解后非常粘稠，需考虑是否因为DNA、RNA这类核酸物质过多，需要加入核酸酶去除，以降低样品粘稠度，提高上样速度及洗脱效果。3. 柱子使用过程中，不能超过填料的压力，以免填料被压塌。4. 每次使用后，可使用5-1 ...

His 标签蛋白纯化效果不理想，宝宝心里苦呀。今天，小编来跟大家一起找找原因。纯化所得组分中没有收集到重组的His标签蛋白。该问题主要可以分为以下两个方面：1、His标签蛋白没有结合到填料上就流穿了原因一超声的功率不对。超声功率过高，容易导致蛋白炭化；功率过低，蛋白释放不出来。建议改变超声功率，同时可以在超声前加入溶菌酶。原因二结合缓冲液条件不合适。建议检查结合缓冲液中是否有影响结合的因素，如：金属离子螯合剂、强还原剂 ...

义翘神州日前曾邀请杨嘉慧博士进行了一场题为「获得高品质重组蛋白实验方案以及经典案例分析」技术公开课，课后收到了很多专业的提问，现将相关的问答简单列举一些，希望能够帮助更多的人获得高质量的重组蛋白。1. 是不是质粒片段越大转染效率越低?解答：一般情况是这样的，质粒片段越大，转染效率越低，但这也与表达宿主有关，不能一概而论。所以有时在进行表达载体优化时，会将质粒的片段或非重要功能区的一些片段进行删减，可以获得较好的转染效 ...

一、用 IPTG 诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂：1M IPTG1. 将目的基因与 IPTG 诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的 LB 平板，37℃ 培养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。2. 分别挑取对照菌和重组菌 1 个菌落，接种于 1 ml 含有相应抗生素的 LB 培养液中，37℃ 通气培养过夜。3. 取 100 微升过夜培养物接种于 5 ml 含有相应抗生素的 LB 培养液中（各 10 份），适当的温度（20－37℃）震荡培养 4 小时，至对数 ...

定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在 ELISA 中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本（ ...

现在 lncRNA 研究已成热点，每天都有很多的lncRNA被发现。今天我们介绍一款在线数据库：网站链接：http://annolnc.cbi.pku.edu.cn/这个数据库界面特别简洁，小编第一看到他就如获至宝：简单明了不矫情。尤其适合英语 low low 的小编。只要找到你研究的那条 lncRNA 序列就好啦。下面看看它的功能随便找一个 lncRNA：NR_002578.2就他了！查询 lncRNA 序列：复制-粘贴到 Annolnc 主页面的文本框里：GO！不错 ...

是不是做 Western 的时候，会遇到这样的情况呢？没错，就是背景很脏。造成背景脏的原因有很多，比如一抗没洗干净，或者二抗没洗干净，还有就是封闭的时候不完全。但其实，封闭液也是你们很容易忽略的一个环境哈。封闭液有几种？除了脱脂奶粉和 BSA 还有啥你们能想到的？第一种封闭液就是脱脂奶粉，这是异常便宜的封闭液品种，当然也应该是你们最常用的封闭液配方了。（甚至我们用过特仑苏）但是，你们应该注意到的是，脱脂奶粉中有大量的生物素，也就是说 ...

1、裂解物制备每道全细胞提取物的 20–30 µg 总蛋白，通常足够用来检测。如果靶标蛋白的基础水平，或蛋白质修饰程度低，可能需要通过化学刺激剂来诱导表达或修饰。你可能要调查备选细胞系或组织，其所含的目的蛋白含量更高。应将样品溶解于适当的缓冲液中，该缓冲液包含蛋白酶抑制剂和针对磷酸化目标的磷酸酶抑制剂。应务必对裂解物进行超声处理，以确保有效的染色质和膜结合靶标的蛋白质提取。请查看我们网站上的对照物表，获得推荐的阳性对照物和 ...

本方法免疫沉淀得到的天然蛋白可用于 western 免疫印迹或是激酶活性分析所需溶液和试剂注意：所有溶液用反渗透去离子水（Reverse Osmosis Deionized water, RODI）或相当纯度的水配制。1. 20 X 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）: (#9808) 配制 1L 1 X PBS 时，取 50 ml 20 X PBS 用 950 ml RODI 水稀释到 1L，混匀。2. 10 X 细胞裂解液: (#9803) 配制 1 L 1 X 细胞裂解液时，取 100 ml 细胞裂解液加 950 ml RODI 水稀释到 1L，混匀。注意：使用前添加 1 mM PMSF。3. 蓝色上样缓冲液（S ...

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当蛋白质处于正常天然构象时, 某些抗体所识别的表位未能暴露出来, 这种情况下需要采取下列方法进行变性蛋白的免疫沉淀。所需溶液和试剂注意：所有溶液均需要用 Milli-Q 超纯水或是相当纯度的其他水配制。1. 变性细胞裂解液：50 mM Tris (pH 7.5), 70 mM β ...

进口胎牛血清提取制备酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在 75% 饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在 10% 硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，后在 PH8.0peng 酸缓冲液中得到结晶。本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。1、胰蛋白酶原的提取与分离：称取 1－1.5 Kg 新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏 (或用 ...

表达载体的构建是生物技术和所需蛋白质产生的基本工具，本文总结了pET-32α（+）载体技术的构建，该技术通常用于研究实验室。该方法包括获得用于构建载体的外源DNA片段，将DNA片段亚克隆到pET-32α（+）表达载体中，在大肠杆菌 BL21（DE3）中进行蛋白质表达以及在大肠杆菌中在天然条件下进行蛋白质纯化。裂解液。介绍作为分子生物学实验室中非常有用的实践，重组DNA技术（或基因克隆）是指将DNA片段从一种生物体转移到自 ...

蛋白质印迹是一种非常适用于蛋白质检测的技术，因为它允许用户量化蛋白质表达。本文主要介绍一些该技术结果异常的排除方法。因为研究人员试图获得一种非特异性但强烈的信号，蛋白质印迹可以被视为一种错综复杂的平衡。即使蛋白质印迹的程序很简单，也会出现许多问题，导致意想不到的结果。该问题可分为五类：（1）异常或意外的条带，（2）无条带，（3）微弱条带或弱信号，（4）印迹背景高，（5）斑点或不均匀斑点污点。不寻常或意外的条带可能是由于蛋 ...

WB 是实验室常见实验之一，蛋白定量后，上样之前，还需要哪些步骤制样呢？1. 蛋白含量测定后，Invent 建议大家把各个样品稀释到某一固定浓度（稀释可使用 PBS，水或裂解液），等体积等质量上样，计算上样体积时需包含 loading buffer 的体积。例如：把所有蛋白浓度都稀释到 2ug/ul，然后与 2Xloading buffer 1:1 混合后，浓度成为 1ug/ul，建议上样 20-30ul 即可。2. 与 loading buffer 混匀后，要将样品在沸水中煮 3-5 分钟，使蛋白充分 ...

丽春红（Ponceau S）染色是 WB 实验中的一个重要环节，今天就来给大家详解丽春红染色的作用和操作方法。丽春红染色作用可用于 PVDF 膜，硝酸纤维素膜和和醋酸纤维素膜上的蛋白的检测。丽春红染色原理丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带。丽春红特性丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS 或其它适当溶液洗去。为什么要用丽春红染色？通过丽春红染色可验 ...

组蛋白的翻译后修饰过程对 DNA 转录，染色体功能以及维护细胞信号传导通路的正常运行具有重要的作用，瓜氨酸化是由称为蛋白质精氨酸脱亚胺酶（Protein Arginine Deiminases，PADs）的酶家族催化的许多关键组蛋白修饰手段之一。PADs 催化肽基精氨酸水解，在组蛋白上形成肽基瓜氨酸，调节与染色质结构相关的许多生化过程。PAD 家族由钙依赖性同工酶 PAD1, 2, 3, 4 和 6 的五个成员组成。组蛋白瓜氨酸化是通过在组蛋白上转化精氨酸而影 ...

蛋白质印迹流程点击下载：蛋白质印迹实验方案溶液和试剂裂解缓冲液这些缓冲液可在 4 ℃ 下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液150 mM NaCl1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）50 mM Tris-HCl pH 8.0蛋白酶抑制剂RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）150 mM NaCl1.0% NP-40 或 0.1% Triton X-1000.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）50 mM Tris-HCl pH 8.0蛋白酶抑制剂T ...