PCR技术

本次在线讲座重点介绍内参在real-time PCR病原体检测中的应用。Real-time PCR可快速、灵敏的检测病毒RNA和DNA以及细菌DNA，因此是许多应用的理想工具。为提高检测过程的安全性，协助对阴性结果的解读，应使用阳性内对照。 此次研讨会将介绍： 1. 病原体分子诊断中的挑战 2. 适用于不同病原体检测的各种内参 3. QIAGEN的新型内参，可用于实验室的不同检测 主讲人： Li ...

第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 引物种类对特异性的影响 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引 ...

胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，多发生于胰头部。腹痛及无痛性黄疸为胰头癌的常见症状。难发现、难治疗、病情进展快、死亡率高。。。。。。这些关键词使胰腺癌登上了新“癌中之王”的宝座。因此，只有10%-15%的患者有手术切除的机会，其中能根治者仅为5%——7.5% 。

PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 一.假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过 ...

对泌尿生殖道感染患者而言，继续忍受病痛的骚扰还是忍受临床检查时采样的痛苦是一个两难的选择，他们中很多人往往因为惧怕采样的痛苦而一再拖延就诊的时间，直到忍无可忍。现在，国内已有检验产品可以尿液作为样本，检测沙眼衣原体（CT）、淋球菌（NG）或解脲脲原体（UU）。尿液是名副其实的无创式取样方式，相比传统的女性宫颈拭子、男性尿道拭子可完全避免取样过程对患者的痛苦和损伤。那么，尿液作为生殖道CT/NG/ ...

Life Technologies公司近日宣布推出了TaqMan®Mutation Detection Assays。这是一个高度灵敏且新颖的研究工具，能够检测到隐藏在100万个正常拷贝的背景之下的单个突变分子。它的核心是castPCR-等位基因特异的TaqMan聚合酶链式反应。

HRM技术 高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM） 是基于核酸的物理性质， 通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种技术。它是在常规PCR基础上增加一种饱和染料， 无需使用序列特异性探针。HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限， 具有高灵敏度特异性、 简单方便、 成本低、 高通量等优点， 可应用于基因分型、 短片段重复序列的分析、序列匹配、 突变扫描 ...

PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。 2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (Loop-mediated isot ...

荧光定量PCR检测技术诞生至今已10多年的时间，而其应用一直都没广泛展开，究其原因，无外乎受制于相关仪器、试剂和技术的发展。近期，尤其是08年以来，仪器和试剂是遍地开花，这也使科研人员均跃跃欲试，都想借此技术使自己的研究能突飞猛进，发展势头通过查找每年所发表的文章数可一目了然。

该讲座主要向我们展示PCR Array简单、准确的定量PCR分析技术。该技术非常适合生物通路和疾病研究；其性能优良，确保了灵敏性、特异性、稳定性和可靠性。从中可以学习到研究人员在癌症、免疫学和毒理学领域的基因表达、microRNA和表观遗传学工作中，是如何应用PCR Arrays。

我们将演示如何使用GENEius试剂产品搜索功能在网站（www.thermo.com / Solaris）上订购合适的Solaris试剂，以及如何用Solaris试剂进行使用标准曲线法的定量PCR。

PCR 基本原理 PCR实际上是通过引物延伸核酸的某个区域而进行重复双向DNA合成，是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法其特异性由引物序列决定。 PCR扩增一个模板需要一对寡核苷酸引物、4种脱氧核糖核苷酸（4dNTP）、摩尔数超过dNTP的镁离子和进行DNA合成的耐热的DNA聚合酶。一般情况下这两段寡核苷酸引物分别与模板DNA上待扩增DNA区段两侧的一段序列互补，并能进行特 ...

PCR反应体系的寡聚核苷酸引物 PCR扩增要选择和设计适当的特异性引物。　　(一)引物设计的原则 　1.一般原则　　(1)引物长度应在15～30bp。其Tm=（G+C）×4+（A+T）×2，引物的有效长度Ln=2(G+C)+(A+T)； Ln38时最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度74℃不能保证引物的特异性。　　(2)引物中碱基的分布应当是随机的避免一连串相同的碱基。3， ...

1、变性温度和时间：模板DNA和PCR产物的变性不充分是PCR失败的主要原因。适宜的变性条件是95℃ 30s或97℃15s。变性不完全，DNA双链会很快复性因而减少产量。在变性中温度太高或反应时间过长会导致酶活性的损失。Taq　DNA聚合酶活性的半寿期:92.5℃为2h以上，95℃为40min，97℃为5min。 2、复性温度和时间：复性温度决定PCR的 ...

PCR反应体系的污染的对策 PCR可从痕量的DNA扩增出大量的DNA产物，由于它的高度敏感性，使PCR也特别容易受到污染。如果一对引物多次使用或以靶序列扩增产物的有无作为诊断的标准，那么必须消除污染以得到有意义的PCR结果。污染的DNA可能有三个来源：来自其他测试样品的DNA，来自实验材料如重组克隆的DNA，或者来自同一靶序列的前一次PCR的扩增产物。最后一种污染，通常称为“遗留”（car ...

全血标本DNA PCR反应模板的制备 【试剂与配制】蛋白酶K：20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5TE缓冲液（pH7.5 或8.0）PBS（磷酸盐缓冲液）钾缓冲液：50mmol/L KCl，10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)， 1%laureth12，0.5 ...

微量和特殊标本DNA PCR反应模板的制备（一）血斑标本【操作方法】　（1） 将血斑剪碎置于试管中；（2） 加1.8ml TES液(含0.15mol/L NaCl10mmol/L Tris-HClpH7.51mmol/L EDTA)浸泡10min；（3） 加10％ SDS 180μl和蛋白酶K(10U)25μl50℃过夜；（4） 用等体积的饱和酚和氯仿各抽提两次；（5） ...

体外培养细胞和组织细胞DNA PCR反应模板的制备 1g哺乳动物细胞，可以得到约2mg DNA。【试剂与配制】（1）磷酸缓冲液；（2）酚/氯仿/异戊醇25:24:1；（3）7.5mol/L醋酸铵；（4）100％和70％乙醇；（5）TE缓冲液；（6）消化缓冲液：100mmol/L NaCl、pH8.0 10mmol/L Tris.Cl、pH8.0 25mmol/L EDTA、0.5％SDS ...

临床拭子标本DNA PCR反应模板的制备 此方法适用于各种拭子标本（鼻、咽、口腔和生殖道等）中DNA的快速制备。 【试剂与配制】PBS-2×Fungi-Bact液钾缓冲液：50mmol/L KCl10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)，1%laureth12，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/ml） 生理盐水无水乙醇T ...

RNA标本PCR反应模板的制备（一） 血液单核细胞RNA制备（1） 用密度梯度法制备血中单核细胞；（2） 取出单核细胞用PBS洗2次，每次300g离心5min；（3） 洗后的单核细胞沉淀用200～400μl含0.5% NP-40的预冷的IHB（0.01% DEPC配制）重新悬起；（4） 离心10sec沉淀细胞核，若有必要，可收集细胞核DNA，但应洗去DEPC；（5） 将上 ...