PCR技术

增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列 退火的引物要符合下面的 一些条件：a.足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60%c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMERf. 避免3 ...

核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例烟头整理1．LAMP引物的设计：LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。F3引物：上游外部引物(Fo ...

欢迎您来到PCR技术讨论版！最后更新：2006－01－12为了方便新老战友了解和使用本版资源，节省宝贵的搜索查找时间，同时避免一些有价值的帖子随时间的推移而被埋没，我将PCR版从改版后至今的所有帖子筛选了一遍，将有价值的帖子分别进行了归类整理，设此子版。如果把PCR技术讨论版看作是一本书的话，这个整理结果就是本书的目录或者索引。在发贴之前先，请您一定先检索一下相关话题的帖子，以避免对您时间和资源的浪费。帖子的整 ...

高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法——HRM技术应用HRM介绍HRM技术是high-resolution melting analysis即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。HRM ...

没有做过Realtime PCR,先查些资料，顺便贴这儿跟新手们分享一下。定量PCR常见问题及对策Q1．无CT值（信号）出现A1．1.反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。2.检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。3.引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。 ...

求助坛内有经验者：在DNA Bisulfite 处理以及甲基化特异PCR的准备工作时候，遇到了一些困难。先不提DNA Bisulfite 处理以及甲基化特异PCR的意义了。1.应该说甲基化特异PCR是1996年开始的，原始论文：Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands (见下贴附件)。其中关于DNA的Bisulfite处理见本贴附件。2.而在《Curre ...

精华帖是一个版块的主要财富，也是广大战友查阅知识的主要途径，其价值正如其名，是精华中的精华。但是由于本版发帖较多，而且有相当一部分战友还不知道如何去搜索精华帖的内容。另外，大部分精华帖现在已经不再置顶，导致精华帖沉底，以致在前几页无法找到精华帖。鉴于此，特发此整理帖。帖子以超链接的形式列出本版建版以来的所有精华帖，以方便广大战友查阅。请广大战友有何疑问先查阅精华帖，相信你会得到一定的帮助。请勿跟帖,谢谢。丁香园引物 ...

看到很多关于RT-PCR的求助贴，而且都是围绕那么几个问题。结合自己做RT-PCR的一些经验，先做个总结，不足之处请各位大虾补充。希望能够抛砖引玉，呵呵。1.RT-PCR时，内参能出来而目的条带不出来的可能原因：(1)RNA部分降解了。很多人都把内参作为判断cDNA模板质量的一个非常重要的标准，认为内参能出来那么cDNA一链质量肯定没问题。但我一直都认为，内参能P出来，仅仅只能说明RT成功了，但与cDNA一链的质量并 ...

最近也要开始做RT-PCR了，关于引物设计，在丁香园学到了不少东西，另外，在外网也查到一些设计引物的方法，于是就把这些知识总结了一下，希望对大家有所帮助。谢谢各位老战友的帮助！PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就 ...

请规范发贴，分享贴请在标题前加【分享】，谢谢您的合作。——by 草根我整理的PCR资料.供大家分享.PCR实验技巧增加PCR的特异性：1. prime理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60%c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或 ...

问 题 可能原因 建议解决方法 RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 RNA被降解在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。RNA中包含逆转录抑 ...

一般的数据分析方法的文献光看中文就够头大，但是这个英文文献很通俗易懂，很适合我们初学者。文中列举了几个实际的例子，可以方便大家参考。Example 1The mean CT of the HOXD10 gene in treated and untreated samples was 24.6 and 27.5, respectively. The mean CT of the 18S rRNA in the treated and untreated samples was 9.9 and 9.8, respectively. What is the fold c ...

PCR常见问题总汇 　PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在 ...

为了方便大家系统理解操作RT-PCR，开个帖子,把有关有RT-PCR相关的问题一起统一回答.如果有重复的问题，或者本帖的回帖中能自行找到答案的问题不会作答。现在将每一页的主要问题整理一下1. RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题2. 植物组织RNA提取的难点及对策3. 如何确定RNA质量的经验谈4. RNA提取常见问题分析RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题 (ZHUAN )假定你抽提 RNA 时使用到的有机试剂 - 氯仿、异丙醇、无水乙醇 - 都是国 ...

a) Primers:i) Oligonucleotide primers are generally supplied as "so many OD units/ml" - but what does this mean, in terms of mg/ml, or mmol/ml, etc?Given: a primer is Y nucleotides (nt) long;Given: the MW of ssDNA is (330 daltons per nt) x (length in nt) (Sambrook et al., 1989; p. C.1);Given: the concentration of primer ( ...

前面说到：请教各位前辈，我做RT-PCR做到悲痛欲绝，肠断无泪。请各位大侠帮我分析。我从培养细胞中提RNA，RNA电泳3条带清晰，比例均可。测RNA浓度，在0.5到3之间，用AMV及随机引物，37度1小时做RT， 以GAPDH（鼎国，400多BP）为内参做PCR，目的基因片段为584BP，反复做，目的基因及内参均未扩出，但可见引物二聚体，请问，那一步出问题？RT还是PCR？是否要换用MMLV（但MMLV扩长片段，我的基因是一短 ...

1.原理，基本步骤http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=4476935&sty=3&keywords=%D3%AB%B9%E2%B6%A8%C1%BFPCRhttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9466944&sty=3&keywords=%D3%AB%B9%E2%B6%A8%C1%BFPCRhttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=6 ...

聚合酶链反 应（PCR）方舟子　　聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。【开发史】　　这项技术的发明人是Kary Mullis。１９８３年，在一家生物高技术公司（Ｃｅｔｕｓ）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮＡ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法， ...

PCR Primer Design (Methods in Molecular Biology) By Anton YuryevPublisher: Humana PressNumber Of Pages: 431Publication Date: 2007-08-02ISBN-10 / ASIN: 158829725XISBN-13 / EAN: 9781588297259Binding: HardcoverIn the past decade, molecular biology has been transformed from t ...

做RT也做了几次,有成功也有失败,在园子中受益良多,把我自已的一个流程放上来,供大家参考.细胞RT-PCR操作流程实验流程一 、取RNA：1、处理细胞：（1）贴壁细胞：先用无菌DEPC水配制的PBS洗细胞两次，弃尽PBS后，直接向培养瓶中加入1ml Trizol，通过溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。当Trizol量不足，可导致RNA中有DNA污染。（2）悬浮细胞：先用无菌DEPC水配制的PBS洗细胞，通过离心沉淀细胞，在 ...