感受态细胞的制备及其转化

稳定细胞株构建的第一个步骤就是细胞转染，这项实验的原理大家都清楚，但是为什么一上手就会出现多种问题，在实验第一步就栽了跟头呢？是细胞转染方法不对头？还是实验过程中的某个因素影响了转染效率？了解本文这11个注意事项，让你的细胞转染实验顺利通关！所谓转染，是指在真核细胞里导入具有生物功能的核酸并核酸的生物功能。通常选用的转染方法包括物理介导法（如电穿孔法、显微注射和基因枪等）、化学介导法（如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染 ...

细胞转染是指将外源分子如 DNA RNA 等导入真核细胞的技术。可分为瞬时转染，稳定转染等瞬时转染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72 h 内分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。稳定转染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体 ...

做感受态的小女孩刚进实验室，师兄就神秘兮兮的对我说，「小师妹啊，师兄我最近要做一项非常伟大的研究，非常需要你的协助。」我：「（星星眼）好哇，要我做什么？」师兄：「听好了啊，师兄我要将扩增好的启动子序列重组到载体中，再将这个重组 DNA 分子导入细菌体内进行表达喔，是不是非常伟大？」我：「（继续星星眼）嗯嗯」师兄：「这个艰巨的任务现在就交给你啦，很简单的，你先做个感受态出来，再将我构建的质粒转进去就好了。"我：「..........（感受态是什么鬼，能 ...

经常提质粒吗？熟练之后，提质粒乃至质粒构建都很简单。但如果真问起一些质粒的细节，可能很多人回答不了。不信随我看看。质粒组成要素一个合格的质粒含有以下组成部分：复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+ 、Kan+。多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms 终止信号加 poly（A）信号 可以起到稳定 mRNA 作用如 ...

luoqq1985 想请问一下这里有没有哪位会用MC1061/P3这种感受态的？因为我之前常用的是Top10和DH-5a以及JCM109，最近要新做一个蛋白的表达质粒，提示要用MC1061/P3这个感受态。所以我想知道这个感受态与其他的有何不同？实验时需要注意什么？谢谢freecell 这个质粒来自何处？为何要用MC1601/P3这个感受态？luoqq1985 这个质粒是表达人的细胞核内的一个蛋白，不是我自己构建的，是别人 ...

慢病毒简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷I型病毒为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。在转染遗传物质到细胞基因组中的工作中，重组慢病毒载体是一个强大和有效的工具，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代培养的细胞，目前慢病毒系统已经被广泛应 ...

将待处理菌液盛于50毫升小烧瓶,先置于冰浴中30分钟，并在超声仪加入一些冰袋（超声仪预冷30分中）。以直径1厘米内插式探头插入菌液中（探头表面最好光滑），最好进行间歇式超声处理，探头距杯底0.5厘米----1.0厘米处不可接触杯底，也不可接触杯壁以防将杯壁超碎。.设置 开15秒 停45秒,12AM超10次左右。（如效果不佳如此反复以效果最佳定次数)（超声能量是100-350瓦.观察指标具体如下：1. 被处理细菌悬液的透明度和温度（完毕后 ...

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。通过本实验学习重组质粒的检测技术。聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种技术。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。PCR进行的基本条件是：（1）以DNA为模板（在RT－PCR中模板是RNA）；（2）以寡核苷酸为引物；（3）需要4种dNTP ...

将质粒DNA导入细菌的过程称为转化（Transformation）。此感受态细菌细胞在CaCl2低渗溶液中膨胀为球状（感受态细菌的制备，见前）。质粒DNA与CaCl2形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，外源基因得到表达。在选择性培养平板上，可选出所需的转化子（即含有质粒DNA的细菌）。 ...

通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备。细菌处于易于吸收外源DNA的状态叫感受态。细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃段时间短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。1.超净工作台2.低温离心机3.恒温摇床4.高压灭菌锅5.恒温水浴锅6．培养皿（二）材料与试剂1．细菌：DH52．100mmol/LCaCl2（灭菌）3．LB培养基 ...

方法一：使用Vector NT 软件做分子实验，经常和不同的质粒打交道，了解各种质粒的图谱信息是必需的，invitrogen公司的这款软件绝对是分子生物学虫子们的福音，要想对质粒图谱了解更直观，安装这款软件是非常必要的。这款软件的软件包里面会包括invitrogen公司的所有质粒图谱信息和其他比较常见和经典的质粒图谱。方法二：查找质粒图谱的网站1. Vector Database（addgene）地址：http://www.ad ...

我曾经认识一个做博士后的家伙，这哥们竟然研究荒谬的怎么用眼睛“猜”菌液的OD值，我当时很是羡慕嫉妒恨，就在yy如果我能够直接用眼睛检测菌液的OD值，那能节省多少时间用于去把妹啊！可惜俺不是具有超能的人，不像我那哥们整个超太，拥有火眼金睛。但是想想把妹，俺日思夜想，闭门自宫（fuck，自宫了还把个pi啊），终于练就了火眼金睛，并写下《葵花宝典》供世人学习。欲练神功，必先自宫，保证除了春哥、月月之类都可以练就的。且看：Step 1: ...

在一个下着雪的圣诞节前夜，一个饥寒交迫的小男孩，手里拿着一个破旧的三角瓶，在大街上走着。他敲开一家大门：“先生，你有板子要倒么？”结果给踹了出去：“没有！扫兴。”再一次：“女士，你有不愿做的板子要我帮忙么？一美分2板。”“谁还倒板子啊，都在做液体培养基。”可怜的小男孩就这样不断的被拒绝。他实在走不动了，疲乏地缩在一个墙角里。他不敢回家，因为他没有倒掉一个板子。家里而且也很冷，风可以从许多地方刮进屋 子里来。他冻得发抖，需要温暖。哪怕 ...

摘要： 核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时可使DNA附在细胞表面利于细胞吞入摄取或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内基因转导的频率大约为10-4这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究.此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法. ...

摘要： 脂质体（lipofectin regeantLR）试剂是阳离子脂质体和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物.它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中是目前条件下最方便的转染方法之一.转染率高优于磷酸钙法比它高5~100倍能把DNA和RNA转染到各种细胞. ...

摘要： DEAE－葡聚糖介导的转染其原理还不清楚可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与 DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系. DEAE－葡聚糖介导的细胞转染其原 ...

摘要： 一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉然而许多在细菌中合成的真核蛋白使得蛋白活性低或无活性.需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白则更需要使用真核转染技术. 一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达 ...

摘要： 核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时可使DNA附在细胞表面利于细胞吞入摄取或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内基因转导的频率大约为10-4这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究.此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法. ...

摘要： 对转染的细胞进行稳定性筛选的具体操作步骤一一介绍. 购买罗氏试剂，积分计划触手可及，缤纷礼品无限选择，欢迎了解详情1．确定抗生素作用的最佳浓度： 不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性因此在筛选前要做预试验确定抗生素对所选择 ...

摘要： 基因启动子的瞬时转染所经过的5个步骤：①确定需要转染的细胞系；②鉴定目的基因的假定启动子区域；③选择报告基因和相应的报告基因分析方法；④将启动子插入到合适载体的报告基因上游；⑤选择合适的转染方法. 购买罗氏试剂，积分计划触手 ...