DNA实验技术

测定DNA 的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA 测序技术发展很快。目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。Sanger法就是使用DNA 聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA 核苷酸序列的方法。它要求使用一种单链的DNA 模板或经变性的双链DNA 模板和一种恰当的DNA 合成引物。其基本原理是DNA 聚合酶利用单链的DNA 模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP，这时，DNA 聚合酶利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3＇-OH，从而终止DNA 链的生长，双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA 的互补链序列。 一、 试剂准备 1.硅化液：四氯化碳250ml，二氯二甲基硅烷25ml。 2.6%变性PAGE胶的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH2O至50

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Protocol For the original protocol describing CGH see the article by Kallioniemi et al . For an example of how this technique has been utilized by the NCI Prostate Cancer Working Group see the section on Cell Lines.DNA RNAProteomicDNA sequence copy number changes throughout the genome in a single ...

TA Cloning exploits the terminal transferase activity of some DNA polymerases such as Taq polymerase. This enzyme adds a single, 3'-A overhang to each end of the PCR product. This makes it possible to clone this PCR product directly into a linearized cloning vector with single, 3'-T overhangs. The PCR products with dA overhang, are mixed with this vector in high proportion. The complementary overhangs of "T" vector and PCR product will be ligated under the action of T4 DNA ligase.

从琼脂糖凝胶中回收DNA ，是一种简单不过的常规实验操作。但是由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验――比如酶切连接、转化筛选、测序或者PCR扩增、标记乃至显微注射等等，所以这一步的操作也显得非常重要。 胶回收的关键参数 胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收，无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂，最基本的评定标准无外乎这么几个:质量（ 回收产物的纯度和浓度） ...

（一）质粒DNA 的提取及鉴定 1．收获细菌 （1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。 （2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。 （3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 2．碱裂解法小量抽提质粒 （1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris �HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。 （2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。 （3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。 （4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。 （5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。 （6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA ，振荡混合，于室温放置2min。 （7）4℃以1

单位定义限制性内切酶的一个活性单位是指，在50μl 的反应体系里，采用随酶提供的 NEBuffer，用1个小时的时间，彻底消化1μg底物DNA所需要的酶量。 酶切反应应在带盖的Eppendorf 管中进行，选用技术数据卡上所标明的适宜温度。在确定酶活性之前，浓缩的酶应该用推荐的贮存液稀释成大约1,000 单位/ml。质量控制所有质量控制鉴定结果都公布在随酶提供的技术数据卡上。非特异性内切酶鉴定为鉴定非特异性内切酶污染，限制性内切 ...

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1. BACs are usually supplied as stabs in agar (2.5 ml screw-top tubes filled with LB agar, stabbed with a toothpick which has been put into a bacterial colony). These are then frozen; at -70℃ they will keep indefinitely, at -20℃ for a year or more, at 4℃ for several months and at room temperature (e.g. during shipping) for a ...

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This protocol describes a method for isolating DNA from plant tissue. Procedure 1. Preheat the CTAB Isolation Buffer at 60°C. 2. Grind 2 g of fresh, leaf tissue to a powder in Liquid Nitrogen in a chilled mortar and pestle. 3. Scrape the powder into a chilled 50 ml tube. 4. Add 3 to 5 ml CTAB Buffer per gram tissue to the tube. 5. Incubate the sample at 60°C for 30 min with occasional gentle swirling. 6. Add the same volume of Phenol:Chloroform to the sample, gently swirling. 7. Centrifuge at 16

1997年2月22日，英国罗斯林研究所的研究人员向公众宣布，经过几个月的精心呵护，他们用体细胞克隆技术培育出来的小绵羊“多利”正在茁壮成长。5天后，也就是2月27日，英国《自然》杂志全文刊登了罗斯林研究所的实验结果。这一消息震惊了世界，人们在措手不及之中迎来了克隆时代。 在中国科学院动物所研究员陈大元的办公室里，摆放着他克隆成功的牛的照片，书柜里陈列着各种有关克 ...

限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA 序列位点上并在此切割双链DNA 。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA 双链而产生带平端的DNA 片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA 片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完 ...

Whole-Genome and Custom Fine-Tiling Array CGHComparative Genomic Hybridization (CGH) measures DNA copy number differences between a reference genome and your sample genome. NimbleGen offers two high-d ...

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ALKALINE PHOSPATASE(CIP) DIGESTION Digestion of protruding 5'-ends 1. Precipitate digested DNA and resuspend in a 100ml of 1X CIP Buffer. 2. Add 1U CIP for 100pmol 5'-ends. 2g linearized 5kb plasmid Å 1.4pmol 5'-ends 3. Incubate 30' @ 37℃. 4. Add 1ml 0.5M EDTA (to 5mM). 5. Phenol-Sevag extract to remove all the enzyme and NaOAc/EtOH ppt. 6. Resuspend in ddH2O or TE-4 @ Å100ng/l. Calf Intestinal Alkaline Phosphatase Boehringer Mannhein #713 023 0.1M Tris-HCl, pH 8.5 10mM ZnCl2 10mM MgCl2 Digestio