DNA实验技术

基因突变是遗传物质分子结构的改变，包括在DNA分子编码区的密码子和密码阅读框的改变。 基因突变可以发生在体细胞，也可以发生在生殖细胞中，这两种突变有完全不同的后果。发生于生殖细胞中的基因突变可以遗传给后代。发生于机体其他组织细胞中基因突变的体细胞突变，可以引起发生突变个体的形态或生理上的变异，只能通过无性生殖的形式传递给后代，而不能通过有性生殖遗传下去(在胚胎细胞 ...

基因突变的分子机制 基因突变包括DNA上碱基对的改变和碱基对的插入或缺失。1．碱基替换 碱基替换是指一种碱基被另一种碱基所替代。当DNA分子中一个嘌呤被另一个嘌呤、或者一个嘧啶被另一个嘧啶所替代时，称为转换(transition)；而嘌呤与嘧啶之间的替换称为颠换(transversion)。碱基替换改变了原有DNA核苷酸的顺序，对多肽链中氨基酸顺序产生影响，导致同义突变、错义突变或 ...

基因工程操作中涉及一系列相互关联的酶促反应。已经知道有许多重要的核酸酶，如限制性内切核酸酶、外切核酸酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、反转录酶、DNA及RNA的修饰酶等，在基因工程的操作中有着广泛的用途。1．限制性内切核酸酶 限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的条件下使每一条链一定位 ...

植物转基因技术 (1)农杆菌介导转化法 将外植体放入含有外源基因的农杆菌(Agrobacteriumtume／ociens)菌液中浸泡，然后转入共培养基，再转入筛选培养基诱导抗性愈伤组织和抗性芽，生根后的抗性植株移栽至营养钵生长。 (2)基因枪法 又称微弹轰击法。其基本原理是将外源DNA黏附在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上 ...

基因工程操作技术及原理之基因克隆1．克隆已知序列的基因 根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。2．功能克隆 根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据 ...

人类基因组研究技术原理--建立遗传图谱 遗传图谱又称连锁图，是指基因或DNA标记在染色体上的相对位置与遗传距离。遗传距离通常由基因或DNA片段在染色体交换过程中分离的频率厘摩(cM)来表示。1厘摩表示每次减数分裂的重组频率为1％。厘摩值越高表明两点之间遗传距离越远，厘摩值越低表示两点间遗传距离越近。 通过遗传图谱，我们可以大致了解各个基因或DNA片段之间的相对距离与方向。如哪个基因 ...

人类基因组研究技术原理--建立物理图谱物理图谱(physicalmap)：物理图谱反映的是DNA序列上两点之间的实际距离，而遗传图谱则反映这两点之间的连锁关系。物理图谱描绘DNA上可以识别的标记的位置和相互之间的距离(以碱基对的数目为衡量单位)，这些可以识别的标记包括限制性内切核酸酶的酶切位点，基因等。物理图谱不考虑两个标记共同遗传的概率等信息。它有多种形式，包括限制性图谱(restrict ...

人类基因组研究--大片段外源DNA克隆体系(1)酵母人工染色体克隆体系(YAC)这种克隆体系是20世纪80年代末发展起来的，并于1990年底渐趋完善的大片段外源DNA克隆体系。插入YAC载体的外源DNA片段可达200 l 000kb甚至更多，并能稳定复制。现在YAC已成为构建复杂基因组的有力手段。(2)黏粒克隆，n噬菌体和细菌人工染色体黏粒克隆的出现早于YAC，其主要特点是插入的外源片段比入 ...

确定特定基因的方法--功能克隆功能克隆是对人类第一个基因克隆的策略。事实上不可能等到人类基因组DNA全部序列都测出之后，再去逐一了解每个基因的结构和功能。在实际研究中，人们认识了-q-基因，知道了它的功能之后，才去分离并测定其结构。进行这一工作的步骤是：①根据已知的生化缺陷特征确认与该功能有关的蛋白。②分离纯化这一蛋白并测定出部分氨基酸顺序。③根据遗传密码推测其可能的mRNA序列。④设 ...

利用染色体特征研究人类基因组 利用染色体的结构和功能特征，如核型、特殊带型、着丝点、复制起点、端粒序列、CpG岛、重复序列等对基因组作图、基因定位和克隆基因都是非常有用的。人们常常是结合染色体的结构和功能特征，采用不同的手段进行人类基因组研究。 1．杂交细胞系与染色体缺失谱 杂交细胞系(somatic cell hybrid mapping panel，SCH)是由分别含有 ...

确定特定基因的方法--定位克隆 由于许多遗传病的基因位点已经有了精确的染色体定位和相应的DNA标记，所以可以用定位克隆的策略分离这些基因。杜兴肌营养不良、慢性肉芽肿、亨廷顿氏舞蹈症等几十个基因的克隆分离就依靠此种方法。 ①通过染色体缺失或平衡易位以及连锁分析，确定该基因在染色体上的位置，并将这个位置精确到2 000 kb左右的范围内。 ②利用距该基因最近的DNA标记，筛选Y ...

基因芯片分析生物信息学 基因芯片或基因微阵列是将很多(数千或数万个)寡核苷酸或DNA作为探针，密集排列于玻片等固相支持物上，将待分析样品标记与微点阵杂交并进行检测。 根据杂交信号强弱及探针位置和序列，可以确定靶DNA的表达情况以及突变和多态性存在与否等。芯片技术的突出特点是高度并行性、高通量、微型化和自动化等，被广泛用于基因转录情况分析、不同基因型细胞的表型分析以及基因诊断、药物设 ...

免费分子生物学软件 互联网上有许多免费分子生物学软件，一些是在线使用的，也有一些可以下载在PC机上使用。(一)质粒作图软件(P1asmidProcessor) PlasmidProcessor是一种免费绘制质粒图软件，可以绘制线状或环状DNA。用户定义限制位点、基因段与多克隆位点，还可插入或删除DNA片段，支持剪贴板、打印和存盘功能。下载站点：http：//www.uku.fi/_k ...

文库构建和模板准备 克隆染色体DNA片段随机文库的构建对于基因组测序的成功至关重要。如果有可能，随机文库最好由机械剪切的片段构建，因为酶切DNA片段化会因为基因组中限制性酶切位点的非随机分布而有所偏向。如果为了生长率差异和体外重排最小而在狭窄的尺寸范围内有相对小的插入，质粒文库最有可能实现完全随机化。如果插入片段至少是平均测序长度的2倍，而且允许每一模板可从没有冗余的两端测序，这样可以显著 ...

PCR产物的检测凝胶电泳分析法 用琼脂糖凝胶电泳来分辨和检测PCR产物是最简单，也是最常用的方法。根据寡核苷酸引物的位置可以预知产物的长度，所以在正确的位置上出现分离的条带通常表示反应是成功的。凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小，监测扩增的情况，还可以用来纯化产物。PCR产物电泳分析中琼脂糖浓度片段大小（bp） 琼脂糖浓度 50～500 ...

琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物（1） 用0.5 X 或1 X TBE 制备2%（W/V）琼脂糖凝胶，加入适量的溴化乙锭；（2） 琼脂糖凝胶的长度与宽度应该与PCR扩增管数量相适应，每一扩增管应有相应的一个电泳泳道，凝胶厚度为3～5mm，一般用三只梳子形成三排加样孔；（3） 将PCR扩增管从PCR扩增仪中取出，用加样器吸取扩增后的反应液，加入相应的 ...

四聚体染色技术【试剂与设备】（1）待检细胞：PBMC，脾细胞，淋巴结细胞或经过相应病毒感染细胞（注意其HLA-A型别）刺激形成的CTL细胞（2）FACS缓冲液（FB）：PBS+2%小牛血清+0.1%叠氮钠（3）2 X HLA-I/抗原肽四聚体：2倍使用浓度的HLA-I/抗原肽四聚体（4）1%多聚甲醛(PFA)的PBS（5）离心机（6）流式细胞分选仪（7）加样器、吸头等【操作步骤】（1）将待检细胞 ...

核酸疫苗接种方法 (1)注射法：医用注射器是最简单和最常用的接种工具。由于骨骼肌细胞并非唯一可以摄取DNA疫苗组分的，根据疫苗的性质特点也可选择其他途径的注射方式，如静脉注射、皮内注射、皮下注射、腹腔注射等。 (2)“无针头”注射导人系统：“无针头”注射装置是一种强力喷射系统，即在高压下使接种物形成细流喷射而出，可穿越组织和细胞。当DNA从该装置中喷出时，DNA在高压下可能发生断裂 ...

干细胞与组织工程 组织、器官的丧失或功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一，也是人类疾病和死亡的最直接原因。据美国权威资料显示，每年有数以百万计的美国人患有各种组织、器官的丧失或功能障碍，每年需进行800万次手术进行修复，年耗资超过400亿美元。我国是一个人口大国，因创伤和疾病造成的组织丧失或功能障碍病例居世界各国之首。据不完全统计，国内每年的烧伤患者达数百万，骨损伤患者高达约千余万，需做 ...

艾滋病的基因治疗进展 艾滋病是最严重的感染性疾病。截至2004年，全球感染艾滋病病毒的总人数已高达6 000多万(其中2 000多万已死亡)。特别是非洲地区，艾滋病已成为头号杀手。艾滋病病毒主要破坏人体的免疫系统，由于目前缺乏有效的治疗方法或特效药物，危害十分严重。发展基因治疗艾滋病的新方法对于艾滋病的预防和治疗都十分重要。目前，艾滋病的基因治疗以对抗病毒感染、干扰病毒反转录、复制、包装， ...