DNA实验技术

相关专题 DNA连接与转化大肠杆菌的基因工程 目的与原理 当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。 二、材料和方法 1. 材料：大肠杆菌 2. 仪器： 离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工 ...

相关专题 DNA连接与转化大肠杆菌的基因工程 下面的简单方案是Clhen等(1972)所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒DNA产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案I快速，重复性更好。该法制备的感受态细胞 ...

相关专题 DNA连接与转化大肠杆菌的基因工程 第一节 概 述 在自然条件下很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内但在人工构建的质粒载体中一般缺乏此种转移所必需的mob基因因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 转化(Transformation ...

相关专题 DNA连接与转化 农杆菌感受态细胞的制备 1.挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml LB液体培养基 (含50mg/L STR)中，28℃、200r/mim培养过夜。 2.取2ml培养物于LB液体培养基 (含50mg/L STR) 中继续培养，直至OD800 为0.5左右。 3.将培养物置冰浴中30min，4℃、5000r/mi ...

相关专题 DNA连接与转化 一、质粒DNA的提取及鉴定 (一)质粒DNA的提取及鉴定 1.收获细菌 (1)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。 (2)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。 (3 ...

相关专题 DNA连接与转化 酶切实验 本实验学习用限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)EcoRI 切割λDNA及质粒pBR322DNA，琼脂糖凝胶电泳后观察酶切结果。 【原理】 λDNA 是大肠杆菌的一种温和噬菌体DNA，双股线状，分子大小为48.5 kb。 EcoRI酶可识别DNA ...

相关专题 DNA连接与转化成功走出第一步：DNA提取 碱变性法提取质粒DNA 质粒(Plasmid) 是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。 分 ...

相关专题 DNA连接与转化 低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的 。 我认为也不一定，要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。 4、平端的连接 ...

相关专题 DNA连接与转化 简介 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻D ...

相关专题 DNA连接与转化 外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可 ...

相关专题 DNA连接与转化质粒 DNA克隆技术是70年代分子生物学发展的重大成果，用限制性内切酶直接切割分离某个外源DNA片段，与此同时用同一种限制性内切酶切割载体DNA，两个DNA产生同样的粘性末端，将它们混合后，二者的粘性末端通过碱基间氢键配对而互补。然后在T4DNA连接酶作用下，使外源DNA片段和载体连接而成为完整的重组DNA分子。 现 ...

相关专题 DNA连接与转化 1实验原理 DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。对于不同的受体细胞，往往采取不同的转化战略。 1.1 DNA重组分子的常用转化方法 1.1.1 Ca 2 诱导转化 1970年Mandel和Higa发 ...

相关专题 DNA连接与转化质粒大肠杆菌的基因工程 1. 实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2. 相关知识及原理 感受态细胞(Competent cells)： 受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl2，RuCl ...

相关专题 DNA连接与转化质粒大肠杆菌的基因工程 为了提高转化效率 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的O ...

相关专题 DNA连接与转化质粒 一、 实验目的 学习外源DNA导入原核生物细胞的方法 二、 实验内容 热激处理将外源质粒DNA导入原核细胞。 三、 实验原理 利用CaCl2处理感受态体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90秒，热休克后，需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便能在含有抗生素 ...

相关专题 DNA连接与转化质粒 转化是将外源DNA分子通过物理或化学的方法导入基因工程细菌中的过程是基因工程等研究领域的基本实验技术之一. 外源质粒DNA转化大肠杆菌 1 实验简介 转化是将外源DNA分子通过物理或化学的方法导入基因工程细菌中的过程是基因工程等研究领域的基本实验技术之一.现演示利用化学的方法(热击法)：使用化学试剂(如CaCl ...

相关专题 DNA连接与转化 实验原理： 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒选用转化和筛选技术可获得含重组的阳性克隆.在此阳性克隆中DNA可在生物体系中大量扩增繁殖保存以及表达目的基因的产物这是PCR体外扩增DNA所不能替代的.配合DNA重组技术所获得的不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研医药生产和生物发酵等领域. 质粒转化不同 ...

相关专题 1、存放:超级感受态细胞必须从干冰运送包装箱取出直接放入–80°C冰箱的底部.一定不要用液氮来存感受态细胞. 1)存放条件:超级感受态细胞对微小的温度改变也极度敏感因此必须存放在–80°C冰箱的底部.即使是将细胞从一个冰箱转移到另一个冰箱也会导致转化效率的损失.采用BD Falcon 的14ml聚丙烯圆底试管:在转化实验中使用圆底 ...

相关专题 DNA连接与转化 4.1 实验原理 4.1.1 DNA的连接策略 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段( 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： (1)互补性粘性末端的连接 单一限制性内切酶或两种限制性内切酶(为同尾酶，如BamHI和BglII)分别处理载体和外源DNA，得到的粘性末端为互补性突出 ...

相关专题 DNA连接与转化 目的与原理 DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶催化，但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作，掌握这一D ...