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碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们.在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内线性的DNA双螺旋结构解开而被变性尽管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起.当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起因此复性迅速而准确而线性的染色体 ...

一、目的及要求1． 掌握提取基因组DNA的原理和方法、步骤。2． 了解相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。二、实验原理制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或 ...

（一）碱变性法提取质粒dna　　质粒(plasmid)是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状dna。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒dna探针技术及检测质粒的pcr技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。　　分离和纯化质粒dna的方法很多但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒dna的扩增，细菌菌体的裂解 ...

1.醋酸纤维素薄膜电泳：醋酸纤维素是指纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质吸附小，能消除电泳中出现的“托尾”现象。具有分离速度快、样品用量小的特点。适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。　　2.凝胶电泳：以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子核 ...

洗脱产物的 DNA量很少或没有常见问题 可能原因 建议解决方案所提样品材料老化或反复冻融导致基因组DNA含量下降应选择新鲜的样品材料，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩的植物组织等，不能及时处理的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存，以免DNA降解。样品破壁或裂解不完全导致基因组DNA未充分释放动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G+细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、酵母破壁酶或机 ...

植物组织提取基因组DNA 一、材料 幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl pH8.0 20mmol/L EDTA 500mmol/L NaCl 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸 ...

Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。该方法的基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。1.基因组DNA(10-30μg)经限制酶切在1.5ml离心管中依次加入DNA（1μg /μl） 20 μg10×酶切 ...

【原理】 Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上与标记的核酸探针进行杂交在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。 一．基因组DNA的限制酶切 【操作】 DNA (1μg/ml)20μg、10×酶切buffer5.0μl ...

概述Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列它包括下列步骤: (1) 酶切gDNA 凝胶电泳分离各酶切片段然后使DNA原位变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(正电荷尼龙膜)上。 (3) 预杂交。 (4) 加入探针进行杂交然后漂洗除去非特异性结合的探针。 (5) 显色/X-光片曝光检测杂交信号，即为目的DNA片段。 Southern杂交的成功 ...

原理：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀 ...

RNA提取原理： 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA 和蛋白混合物中 ...

目的要求（1）了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。（2）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的 ...

1．报告基因检测受多种因素影响（载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等），因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。2．细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。3．双荧光素酶报告基因的载体选择：a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；b)海肾 ...

1 应用说明编码β-半乳糖苷酶(Gal)的基因已商业化地运用到报告基因研究的各种层面，重组的β-Gal已得到成熟的运用，以此用来研究启动子的功能、组织特异性表达、发育调控、mRNA的稳定性以及各种细胞器靶向蛋白的信号序列。应用β-Gal来测定启动子和基因的活性具有双重优点；检测方法简单，用于酶活性分析的底物容易获得，使用TBS-380微型荧光计对溶液中β-G ...

1. 应用说明在分子生物学的许多试验中，DNA定量都是一个很重要的步骤。用到DNA的常用技术有序列分析、cDNA合成和克隆、RNA转录、转染、核酸标记（比如随机引物标记）等等，这些试验的好坏取决于所使用模板浓度，对所用DNA模板浓度错误估计往往是导致这些实验失败的最直接原因。核酸的浓度通常用紫外，在260nm波长处，测吸光值获得，检测中的灵敏性会受到很高的背景干扰。Hoechst 33258，一种 ...

1. 应用说明AcGFP1是从水母（Aequorea coerulescens）中分离出来的荧光蛋白，是EGFP的优良的代替品。AcGFP1的特性与EGFP相似，AcGFP1的激发波峰为475nm，发射波峰为505nm。此外，AcGFP1与EGFP在核酸水平上有94%的同源性。AcGFP1的特点是具有进行了人类密码子优化的开放阅读框。这不仅提高了AcGFP1 mRNA的转化效率同时也提高了它在高等 ...

1．应用说明疫苗是现代疾病预防中常用的控制方式。如今许多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组乙肝疫苗、狂犬病疫苗等大多数疫苗都采用细胞培养的方法生产。其中，疫苗的纯化是关键问题，我们需要尽可能的去除宿主细胞DNA和宿主蛋白。假若宿主细胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人体将会产生不可预料的后果。常规的DNA含量的检测方法是在260nm（A260）处测其吸光值。这种方法的主要缺点是核苷酸、单链核酸和蛋白质对信号 ...

将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种，这些方法各个实验室都有用过，但最常用的是使用转染试剂，这些转染试剂有的是阳离子脂质体，有的则不是。下文除了介绍各种转染方法外，在文章末尾还列出了常用的RNAi转染试剂。1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过 ...

在进行染色质荧光原位杂交以及其他与染色体相关实验方法中，制备染色体是实验的第一步，本文就此对体外传代培养的细胞，外周血细胞，羊水细胞的染色体制备方法进行介绍。1） 传代培养细胞染色体显示法1．培养细胞：取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80％～90％汇合单层培养细胞。2．加秋水仙素：使用最终浓度为0.02～0.8微克/毫升营养液，温箱继续培养6～10小时；或用低温封闭法：把培养细胞置于4℃条件下 ...

外界物理因素:温度、湿度 化学因素：pH值、水解反应、氧化反应 生物因素：酶解及微生物侵染等作用。这些因素都直接与DNA的构型、分子组成有关DNA分子结构： DNA是由许多脱氧核苷酸残基按一定顺序彼此用3’，5’-磷酸二酯键相连构成的长链。 ；大多数DNA含有两条这样的长链 也有的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等。有的DNA为环形，有的DNA为线形。一般用几个层次 ...