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转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA （质粒和线性双链DNA ），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。转化特指将质粒DNA 或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试

Purpose Materials10ml 6% dextran + 7ml citrate/citric acidDextran: T500 --> 6g+100ml PBSCitrate solution: 25g Na Citrate + 8g citric acid + 500 ml PBS 43 ml blood 12 ml RT Histopaque 107718 ml cold H2 O2 ml 10x PBSM199 for HUVECs: 1L powder pocket M199 + 35g NaHCO3 + 25mM Hepes + 5 mM glutamine + 50 ug/ml Gentamycin.1M Hepes: 119.1 g Hepes + 500 ml dH2 O.Media A: 1X HBSS (10X:50ml) + 10 mM Hepes (1M: 5 ml) + 5 mM EDTA (0.5M: 5ml) + 2.5 % FBS (12.5 ml) in 500 ml.Media B: RPMI1640 470 ml + Ge

一、环境和液流的消毒1、准备足量的无菌1×PBS（3L左右）和去离子水（10L左右）。PBS和去离子水可高压灭菌，sheath桶和装DI水的5L小桶依次用75％ 医用酒精和无菌去离子水各涮洗三次，然后将无菌PBS和去离子水分别注入相应桶内即可。2、房间在分选前紫外灯照射15－20分钟；用1:50新洁尔灭拖地；用75％ 医用酒精擦拭工作台和收集架；用75％ 医用酒精喷洒分选细胞收集区和上样区。二、开机和管道的消毒1、将Sheath液换为活性氯浓度为0.5% 的次氯酸钠溶液（不要用75％ 的酒精），开机。开机前，先掀起流动室和分选室的罩盖，开启电源，打开计算机并等计算机进入WINDOWS系统后，打开激光电源，运行FACSDiva软件，联机成功后，执行Fluidics startup命令。然后从FACSDiva的sort菜单进入sort setup，选择合适的液流压力（high、 middle、low）。一般来说，100 μm的喷嘴选用Low，而70 μm的喷嘴选用middle。2、打开breakoff window，点击显示窗上的液流开关，检查液流是否正好流入废液槽中间和液流的形态是否正常

1. 原理RT—PCR 是一种将 cDNA 合成与 PCR 技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析, 还可以用来检测基因表达差异而不必构建 cDNA 文库克隆 cDNA。 RT-PCR 的模板可以为总 RNA 或 poly(A) 选择性 RNA 。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT) 或基因特异性的引物（GSP）起始。 在实际应用中，RT—PCR 又常常分为一步法 RT—PCR 和两步法 RT—PCR。2. 特点一步法 RT—PCR 反应更加快速、灵敏，操作简便，污染率低，RNA 二级结构减少，并且因为聚合酶有校正活性，从而降低了 PCR 反应的错配率。而在两步法中，反应的精确度高，人为的误差相对较小，并且由于在第一步中将 RNA 反转录为 cDNA，从而更易于保存。 另外，两步法的整个过程比一步法更节省费用。传统检测方法的样品用量一般在 ug 级，而在 RT—PCR 检测系统中样品用量陡降至 pg 级。这就在很大程度上降低了实验操作的难度，特别是 mRNA 样品制备的过程得以简化。3. 应用对基因转录产物进行定性与定量的检测，

聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。 无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。 实时荧光定量 PCR 技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称 Real Time PCR）是在定性 PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术。 实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied biosystems 公司推出，在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，使每一个循环变得「可见」，最后通过 Ct 值和标准曲线对样品中的 DNA(or cDNA) 的起始浓度进行

由于 Real-time qPCR 的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验，也基本上被 real-time qPCR 所代替。由于 real-time aPCR 输出的数据不同于常规的 PCR 电泳检测，很多没有做过 real-time qPCR 的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从 real-time qPCR 的发展史说起，包括 real-time qPCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解 real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经

内参就是内部参照，一般是指管家基因编码表达的蛋白，它们在各个组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照参。内参则可以校正蛋白质定量、上样过程中存在的误差，保证实验结果的准确性。此外，内参可以作为空白对照，还可以检测蛋白转膜情况是否完全、整个 WB 显色发光体系是否正常。内参抗体种类很多，比如 β-Actin、β-Tubulin、GAPDH 等，下面简单介绍下如何选择内参。 一、目的蛋白分子量选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差 5KDa 以上。比如检测目的蛋白分子量为 45KDa，此时不适宜选择 β-actin（42KDa）作为内参，可以考虑选择 GAPDH（36KDa）作为内参。二、种属不同种属的样本内参蛋白不同。如哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择 β-actin、β-tubulin、GAPDH；植物来源实验样本，则可以选择 Plant actin、Rubisco等。 三、定位不同表达部位内参蛋白不同 四、样品前处理（常常被忽略的内参选择因素）内参的选择还需要考虑实际的实验环境和样品的前处理。在某些特

基因工程的诞生基因工程是分子水平对生物遗传作人为干预，要认识它，我们先从生物工程谈起：生物工程又称生物技术，是一门应用现代生命科学原理和信息及化工等技术，利用活细胞或其产生的酶来对廉价原材料进行不同程度的加工，提供大量有用产品的综合性工程技术。生物工程的基础是现代生命科学、技术科学和信息科学。生物工程的主要产品是为社会提供大量优质发酵产品，例如生化药物、化工原料、能源、生物防治剂以及食品和饮料，还可以为人类提供治理环境、提取金属、临床诊断、基因治疗和改良农作物品种等社会服务。 生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程等 5 个部分。其中基因工程就是人们对生物基因进行改造，利用生物生产人们想要的特殊产品。随着 DNA 的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由信使 RNA 转录表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。如果将一种生物的 DNA 中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的 DNA 链上去，将 DNA 重新组织一下，不就可以按照人类的愿望，设

随着人类基因组计划取得巨大的成功和许多物种基因组测序的完成，仅仅靠基因组的序列来试图阐明生命现象是远远不够的，因此，研究重心已经开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上，生命科学已实质性地跨入了后基因组时代。尽管现在已经有多个物种的基因组被测序，但这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组研究中所采用的策略，如微阵列法（microarray）（Wodicka et al.,1997）、基因芯片（gene chips）（Ramsay et al.,1998）、基因表达序列分析（SAGE）（Velculescu et al.,1995）等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的。但事实上，从DNA、mRNA到蛋白质存在三个层次的调控，mRNA自身也存在着贮存、转运和降解等问题，从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。蛋白质复杂的翻译后修饰，蛋白质的亚细胞定位或迁移，蛋白质-蛋白质相互作用则几乎无法从mRNA水平来判断（曾嵘

多元PCR(多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一个 PCR 反应中使用一个模板和几对引物同时扩增多个目的片段的 PCR 反应。这项技术非常有用，他不仅可以提高 PCR 的产率还能提高?DNA?样品的利用率。另一种形式的 MPCR 是组合 PCR, 组合 PCR 是在同一 PCR 反应中使用几个不同的模板和几对引物。多元 PCR 和组合 PCR 往往被当作同义词使用。设计策略MPCR 要求所有的引物对在同一条件下扩增其各自的特异序列。大多数多元 PCR 反应 局限于扩增 5~10 个目的片段，原因之一是反应中，每另加入一对引物会导致一定程度的灵活性的丢失。引物数量的增加也使引物二聚体和非特异扩增出现的概率增加。因此，进行多元 PCR 要求周密计划，且需多次尝试，使反应条件优化。理论上，一个多元反应中，所有引物扩增其特异序列的效率应该是一样的，但通常是很难预测一对引物的效率。在相似条件下，退火温度几乎相同的寡核苷酸可更好地工作。多元 PCR 引物设计和优化的一般规律当设计 MPCR 引物时，除了引物设计的一般规律外，其他一些因素也必须考虑。一般 来说，一个多元反应中

开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本次讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。 你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0 ” 。第二步：贴上模板序列。 进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（如下图）在“Paste source sequence below (5'->3'…”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。第三步：重要参数设定。 首先是“ Product Size Ranges ”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。第二个

在体外将两个或多个来源相同或不相同的 DNA 片段连接成新的重组 DNA 分子，再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。DNA 重组技术的基本程序包括：（1）获得外源 DNA：外源 DNA 是进行 DNA 重组的目的 DNA 片段，一般采用 DNA 聚合酶链式反应 (PCR) 或逆转录-DNA 聚合酶链式反应 (RT-PCR)、基因组文库或 cDNA 文库筛选等方法获得。（2）载体的构建或选择：分子生物学中用的载体是指能在特定宿主细胞中自主复制的 DNA 分子，例如细菌的质粒、噬菌体、病毒等，常用的载体一般为质粒；根据需要可直接从公司购买合适的载体，也可以自己构建。（3）连接：目的 DNA 片段和适当载体的连接, 一般采用核酸内切酶分别消化 DNA 片段和载体，使它们的末端能够连接到一起构成重组 DNA 分子。由于所用内切酶的切割特点不同，产生三种连接方式：粘端连接、平端连接和不相配的连接。（4）转化：将连接的重组 DNA 产物导入合适的宿主细胞，使其在宿主细胞内复制扩增或表达，赋予宿主细胞新的生物特征。（5）克隆化：重组 DNA 分子转化大肠杆菌后，在平板

一、热启动 PCR热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行 PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如 site-directed 突变、表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动 PCR 尤为有效。 限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反应液，并将其置于预热的 PCR 仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一

DNA 序列的改变称为突变, 这将导致相关蛋白质的序列变化。 DNA 上特定核苷的取代技术称作基因定位突变法 (site directed mutagenesis)。 通过病酶动物将突变的基因导入微生物体内即可产生非天然蛋白. 这种方法在研究蛋白质中特定氨基酸的功能上极为有价值。与定位突变不同, 在 PCR 中增加 Mg2 离子可产生随机点突变; 高盐度降低了 DNA 聚合酶的再现精度。突变频率可由离子浓度控制。这种方法称作"易错 PCR"。将突变基因重组在加速产生多样性方面较定位突变效率更高。这种方法称作 DNA 改组技术 (shuffling)。

实验原理核酸分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在 DNA 与 DNA、RNA 与 RNA 或 RNA 与 DNA 的二条单链之间进行。由于 DNA 一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链 DNA 分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高 pH 值来实现。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。随着基因工程研究技术的迅猛发展，新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型：一、固相杂交将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶 DNA 自我复性等优点，所以

随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现。尤其是 PCR 技术问世以后，各种与 PCR 相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展。如不对称 PCR 产物的直接测序 、核糖核酸酶酶切法 (Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段长度多态性分析 (Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 等等已成为基因分析的有力工具。但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件高，不适合一般临床实验室使用。1989 年问世的 PCR-SSCP(下文称 SSCP) 作为检测基因突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还被用于 DNA 定量分析，监测 PCR 诊断实验中的交叉污染情况，以及传染源的调查等。由于 SSCP 的突出的优点，近几年被大量地应用。一、SSCP 的原理及特点日本 Orita 等研究发现，单链 DNA 片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或

Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的 DNA 样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂交信号。通过 Southern 杂交可以判断被检测的 DNA 样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA 指纹分析和 PCR 产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替 Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性 (RFLP) 的检测等。一、基因组 DNA 的制备（前述）二、基因组 DNA 的限制酶切根据实验目的决定酶切 DNA 的量。一般 Southern 杂交每一个电泳通道需要 10-30 μg 的 DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的 10 倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用 2-4 U 的酶消化 1 μg 的 DNA。消化的 DNA 浓度不宜太高，以 0.5 μg/μl 为好。由于内切酶是保存在 50% 甘油内的

第一个用于研究细胞骨架的药物，它是真菌分泌的生物碱。细胞松弛素(细胞松弛素 B 及其衍生物)在细胞内同微丝的正端结合, 并引起F-肌动蛋白解聚，阻断亚基的进一步聚合。当将细胞松弛素加入到活细胞后，肌动蛋白纤维骨架消失，使动物细胞的各种活动瘫痪, 包括细胞的移动、吞噬作用、胞质分裂等。它对微管没有作用, 也不抑制肌收缩, 因肌纤维中肌动蛋白丝是稳定的结构, 不发生组装及解聚的动态平衡。

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术。 作为应用流式细胞术进行检测的技术平台，现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟，并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。 流式细胞术-概述一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA 含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。 根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。目前最高分选速度已达到每秒钟 3 万个细胞。 现代流式细胞术综合了流体力学技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、荧光化学技术及单克隆抗体技术，是多学科多领域技术进步的结晶。随着现代科技的高速发

组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。莱卡倒置显微镜进入 20 世纪 80 年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。