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CRISPR 是一种基因编辑技术，由 Cas 核酸酶和 sgRNA 组成，可以对生物的 DNA 序列进行定向切割、修改，被 Nature 杂志列为 2013 年年度十大科技进展之一。而将 CRISPR 与荧光成像结合，就可以建立一个活体成像系统，实现对特定基因位点标记成像，并进一步在基因的生物学功能研究中发挥着重要的作用。在活细胞中实时监测内源基因活性对于研究基因的生物学功能并调控其表达水平至关重要。近年来越来越多证据表明，低表达基因虽然表达量较低，但是在各种生物学过程中往往起着重要的调控作用；此外，基因组中编码蛋白质的基因只有 1%-2%，大部分为非编码 RNA，其中长链非编码 RNA（Long non-coding RNAs）具有非常重要的调控功能（图 1），多达 78% 的 lncRNAs 表达具有组织特异性 [1]。图 1：lncRNA 功能示意图近年来越来越多证据表明，lncRNAs 不仅参与各种生物学过程和通路，而且与各种疾病的发生发展紧密相关。但是受现有标记技术的限制，对低表达基因和 lncRNAs 的功能注释极具挑战性。近日，《Nature Cell Biology》期

引言在哺乳动物的早期发育过程中，胚胎干细胞 (ESC) 经历细胞分化并产生所有胚胎生殖层，这些层最终在成年生物体中分化为多种细胞类型。 ESC 的特点是具有难以置信的自我更新和增殖能力，由于间隙期（G1 和 G2）截短，因此其分裂周期较短。 在细胞分化过程中，会发生标志性的细胞事件： 细胞改变形态，生长至约为其原有大小的十倍，并改变细胞核与细胞质的比率，同时细胞变得扁平和拉长； 命运特异性基因表达程序被激活，并发生全局染色质修饰。 重要的是，细胞周期减慢。 分化的体细胞具有较长的G1期和G2期、严格的检查点控制和井然有序的分裂周期（Padgett 和 Santos，2020 年）（图 1）。细胞周期重建不仅仅是 ESC 分化过程中发生的一种现象。 细胞周期动力学的变化在生物学领域经常发生。 例如，当细胞在受到病毒感染后或出现恶性肿瘤期间经历再生时。 因此，研究细胞分化背景下的细胞周期动力学变化对于理解细胞周期控制的潜在保守机制非常重要，并将对我们理解健康和疾病状态之间的平衡产生影响。通过测量参与细胞周期不同阶段的基因编码蛋白的活性，可以监控分化过程中单个细胞发生的变化（Araujo 等

简介细胞增殖/细胞毒性测定是涉及培养细胞的研究中最常用的测试之一。 其是检查用于治疗的药物浓度的基本初步测试，也是确定各种研究领域（如肿瘤学和细胞死亡）药物疗效和安全性的非常重要的测试。传统上，WST-8 或 ATP 检测（使用代谢活性作为指标）和 BrdU 或胸腺嘧啶核苷检测（使用 DNA 合成水平作为指标）已用于细胞生长特性的定量评估。 尽管这些检测由于其简易性和吞吐量而对我们有益，但这些检测都是间接评估方法，因此结果可能与实际细胞数无关。 在许多情况下，这些检测是终点评估，有时会导致无法捕获时间序列的变化，导致重要发现被忽略。由于这些局限性，我们认为，直接和时间评估细胞增殖/细胞毒性的方法的发展对于使用培养细胞的研究领域是重要的。试验大纲为了验证 Evident Provi CM20 培养监测系统的细胞增殖/毒性评估能力，我们进行了以下两项检测，以将 CM20 系统与传统检测 (WST-8) 进行比较：抗癌药物 (5-FU) 对人肺腺癌 A549 细胞的细胞死亡检测神经毒素 (6-OHDA) 对人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞的细胞死亡检测试验程序使用抗癌药物 (5-FU)

实验大纲骨髓间充质干细胞是多能干细胞。因此，作为再生医学的细胞来源，它是活性研究和临床应用的目标。当骨髓液或骨髓细胞接种在培养皿上时，间充质干细胞会作为粘附细胞增殖。因此，间充质干细胞可以从漂浮的血细胞中分离出来。在此，我们报告了使用 Evident Prov CM20 培养监测系统对间充质干细胞原代培养的远程监测结果。试验程序使用补充了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素链霉素的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM），将市售人骨髓细胞以 950,000 个细胞/0.5 ml/孔的密度接种在 24 孔板（Sumitomo Bakelite，目录号 MS-80240）上。使用 CM20 系统每小时对细胞进行一次自动聚焦成像。由于在培养的第 4 天观察到粘附细胞的增殖，因此在更换培养基后对其进行长达 6 天的监测。结果图 1.骨髓间充质干细胞的原代培养。箭头表示骨髓来源的间充质干细胞。大多数细胞是血细胞，接种后未立即观察到间充质干细胞。然而，在接种后第 4 天，出现了具有纺锤体形态的间充质干细胞。随后，更换培养基以去除血细胞。接种后第 6 天，发现间充质干细胞增

衰老与肝脏代谢衰老是一种不可抗的自然规律，其主要生理表现为生活习性、形态变化及身体系统器官机能状态的改变。器官机能状态改变包括主要代谢器官代谢模式的改变，易引发代谢性疾病，如肥胖，高血糖，脂肪肝等 1。肝脏作为重要的代谢器官，在衰老过程中代谢功能明显降低 2, 3，表现为肝脏细胞中甘油三脂含量显著增加，脂质分解受损，脂肪酸氧化作用受到抑制等 4, 5, 6。肝脏中的许多代谢过程也表现出受主昼夜节律调节的节律变化，并且这些代谢过程随着年龄的增长而表现出渐进性改变。据报道，在年轻小鼠中节律表达的基因中有 44.8% 在老年小鼠中表现出节律紊乱；这些基因主要参与甘油代谢和甾醇代谢 7。昼夜节律基因的缺乏，如 Bmal1 和 Per1/2 ，会加速衰老过程 8。虽然新陈代谢和昼夜节律之间的联系已被证实，但在衰老过程中彼此如何在肝脏中解耦联仍然未知。肝脏脂质代谢与生物节律2023 年 3 月 24 日，南京医科大学李朝军、南京医科大学附属逸夫医院薛斌及复旦大学李蓬共同通讯在 Nature Communications 发表题为 「The rhythmic coupling of Egr-1 an

激光诱导 DNA 损伤后 U2OS 细胞的活细胞成像双链 DNA 断裂是对 DNA 损伤最有害的形式之一。损伤之后，细胞中的 DNA 损伤反应（DDR）通路被触发，诱导 DDR 因子募集到断裂位点，并启动细胞周期检查点信号传导和 DNA 修复活性的调控。精准的信号转导和断裂位点修复对于细胞的生存和防止致癌突变至关重要。因此，了解 DNA 修复过程中的相关机制尤为关键。在此应用中，我们使用 FV3000 共聚焦显微镜，研究了 U2OS 细胞（人骨肉瘤上皮细胞）DNA 修复蛋白在激光诱导损伤处（包括双链 DNA 断裂位点）的募集过程。采集的图像不仅帮助我们确定募集到断裂位点修复蛋白的动力学信息和聚集水平，还验证了内源转录调节因子和 DDR 通路因子在 DNA 断裂位点的共定位。图 1：实验方案示意图将 MRE11 cDNA 克隆到带有 GFP 标签的表达载体中，然后将其转染到 U2OS 细胞。在使用溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）或 Hoechst 进行标记后，使用 FV3000 共聚焦显微镜的 405 nm 激光对核内目标区域（ROI）进行线扫描诱导 DNA 损伤。随后使用 488 nm 激

摘要NoviSight 3D 细胞分析软件可通过测量体积、球形度和细胞数等参数提供有关微球和其他 3D 对象的统计数据。本应用指南将介绍用于活/死微球测定的 NoviSight 3D 细胞分析工作流程。引言使用微球或类器官进行 3D 高内涵分析（HCA）的难度可能很大。理想情况下，我们可以通过三维方式分析 3D 样品获得有关形态和内部条件的信息。NoviSight 软件的真实 3D 分析可通过基于连续 Z 序列荧光图像测量 3D 样品的体积、细胞数量和细胞状况，从而简化这一过程。另一方面，常规分析使用的单个图像切片（图 1，左，2D 分析）或使用投影图像（图 1，中，2.5D 分析）。这两种技术均会从 3D 样品中丢失诸如空间、形态和体积信息等大量数据（图 1）。图 1 (从左到右)：2D、2.5D 和 3D 分析示意图。在本应用指南中，我们介绍如何使用活/死微球测定法通过 NoviSight 软件定量分析 3D 样品。方法样品制备我们在 PrimeSurface96U 孔板（Sumitomo Bakelite）中培养 500 HT-29 细胞/孔八天以形成微球，然后第二天用 NucV

一个视频带你了解免疫组化实验背景、实验原理、实验流程、常见问题解析等内容，轻松入门。

图 1 实验流程与常见问题索引Q1：染色结果呈阴性，是怎么回事？（1）抗体来源选择错误：本试剂盒二抗为抗兔/鼠，请确保一抗来源的种属为兔源或鼠源。（2）组织切片本身不存在目的蛋白：可通过 The Human Protein Atlas 数据库或 UniProt数据库查询目的蛋白在细胞或组织中的表达情况。（3）抗体浓度和质量问题：提高抗体工作浓度或延长孵育时间；确认抗体可进行IHC实验，通过非IHC实验排除抗体质量问题。（4）脱蜡不完全：可根据切片上是否存在透明颗粒，判断是否存在脱蜡不完全，若存在，需延长脱蜡时间或换用新的二甲苯。（5）抗原修复不完全：对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合。（6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应：可加入组织透化步骤，进行细胞膜或核膜的透化。（7）试剂盒保存不当：请于 4℃ 进行保存，勿室温防止过长时间。（8）封闭时间过长：若使用封闭液进行封闭，请排除封闭液对抗原抗体结合的影响。Q2：免疫组化染色弱怎么办？（1）抗体浓度过低，孵育时间过短：可提高抗体浓度，进行抗体4℃过夜孵育。（2）组织或细胞中目的抗原表达水平低：可

近年来,中国癌症患病人数与死亡人数不断增多,已成为全球第一「癌症大国」。在癌症的临床诊断中，病理诊断一直以来被称之为「金标准」。通过病理诊断准确反映疾病发生的本质、疾病过程中患病机体的形态结构和功能代谢的改变，对于癌症的诊断、个性化用药治疗、预后分析、疗效监测、早诊早筛都有很重要的参考意义。图 1 中国全癌种发病人数(万人)病理诊断常见方法中，主要包括组织病理、细胞病理、分子病理、免疫组化病理；其中组织病理和细胞病理主要为病理形态学观察后进行定性诊断，分子病理为从基因水平上检测细胞/组织样本的遗传物质变化，免疫组化病理则是利用抗原抗体特异性结合的原理，对组织和细胞标本中的目标抗原进行定位、定性、定量检测，从而准确真实的反映目标抗原的实际表达情况，实现肿瘤蛋白表达层面变化的检测。图 2 病理诊断常用方法四大常见病理诊断方法中，免疫组化病理检测技术自建立以来，经不断改良、发展，在20世纪80年代达到发展高峰，基于抗原抗体特异性结合的检测原理，免疫组化病理检测衍生出了不同的技术手段：免疫组化（IHC）、多重免疫组化/荧光（mIHC）、荧光免疫组化（IF）、细胞免疫组化（ICC）等。以IHC为

免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种以抗原抗体特异性反应为基础，对组织或细胞中特定抗原（通常是蛋白质）的定性和定位分析的实验方法。免疫组化可以在微观层面上反映出疾病过程中细胞内蛋白质的表达变化，对于病理诊断和研究具有重要价值。通常，根据显色剂（酶、荧光素、同位素、 金属离子等）与样品类型的不同，将免疫组化作以下分类。图 1 免疫组化病理分类IHC/ICC（统称为免疫组化）是指通过酶标记物在组织、细胞原位通过抗原抗体反应和化学的显色反应，对特定抗原进行定性和定位。IF（免疫荧光检测）是采用荧光素标记物作为探针，形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，受激发光的照射后发出一定波长的荧光，从而对细胞、组织中的抗原进行定位或定量。表 1 IHC/ICC与IF特点对比IHC/ICC 与 IF 染色中使用的抗体主要为一抗与二抗，根据是否选用二抗以及二抗标记物类型可形成多种不同的检测系统。信号放大是免疫组化实验中的重要步骤，信号放大可以使目标蛋白质的信号从微弱到明显，从而更容易被观察和定量。现有的信号放大技术多为链霉亲和素-生物素法，该方法基于链酶亲和素与生物

高质量血清血浆外泌体如何提取

1、如何增加外泌体试剂盒的提取效率？答：首先，样品准备阶段确保样品的质量和数量充足；在提取阶段，加入ECS试剂后可以通过增加静置时间来提高提取效率，但同时也可能影响到纯度，因此静置时间也需要适当控制，初次实验可以考虑静置过夜。2、离心后无法看到沉淀如何处理？答：样品中的外泌体是微量的存在，离心后无法看到沉淀属于正常现象。建议离心后用PBS重悬沉淀时不仅洗脱肉眼可见的沉淀部位，还要吹洗离心管外侧靠近底部的狭长区域，具体位置根据离心机倾斜角度决定。建议在下次样品准备阶段确保样品的质量和数量充足，干细胞/原代细胞上清可在提取前采用超滤管（100KD）浓缩3~5倍后再提取。3、使用EPF柱时堵塞如何处理？答：过滤柱的孔径在220nm左右。如果出现堵塞情况，可以将柱子旋转180度再次离心。若上室还有残留液体，需要使用新的EPF柱，该柱子可以单独购买（货号UR90102）。4、沉淀法的具体原理是什么？答：将高亲水性聚合物（聚乙二醇等）添加到含外泌体的溶液中后，外泌体周围的水分子被聚合物束缚，降低了外泌体的溶解度并诱导其随后的沉淀，使外泌体在低速离心下可以很容易沉淀。5、开封后的ECS试剂有沉淀出现

近年来，外泌体在生物医学领域引起了广泛的关注。外泌体主要是指由哺乳动物细胞主动向胞外和体液中释放的纳米级双层囊泡小体，携带多种遗传物质，可通过自分泌或旁分泌途径被细胞吸收，也可经循环系统被远距离靶组织或器官所吸收，参与机体多种生理和病理过程。由于外泌体携带着丰富的生物信息分子（例如蛋白质、核酸等），因此也能够在细胞间通讯、免疫调节、疾病发生发展等多个生物学过程中发挥着关键性作用。此外，也正是由于外泌体所蕴含的巨大潜力，科学家们对其寄予厚望，并期望它们能成为未来疾病诊断和治疗的新星。为了帮助广大医学科研工作者快速掌握和了解外泌体研究领域的最新动态，今天就给大家盘点一下外泌体研究领域近期发表的 10 篇高分文章，供大家阅读和学习，希望可以给相关研究领域学者带来新的研究思路（。1. 细胞外囊泡（EV）蛋白冠可影响其在肝细胞中的摄取以及体内分布情况2024 年 2 月 16 日，英国伦敦伦敦国王学院生命科学与医学学院药物科学研究所研究团队在Nature Nanotechnology（影响因子：39.9）期刊发表了题为：Cellular uptake and in vivo distributi

全球范围内，心血管疾病与癌症死亡率分别占居民疾病死亡总数的 32% 和 26%。许多心衰患者死于非心血管疾病，包括癌症。多项临床流行病学和前瞻性队列研究发现，与未患心血管疾病的人群相比，心血管疾病患者罹患癌症的风险更高；携带较多心血管疾病风险因素的人群患癌风险也更高。已有研究表明，心衰加速肿瘤生长，心衰促进肿瘤生长可能与心脏分泌相关因子SerpinA3有关。2023 年 3 月 27 日，哈尔滨医科大学药学院的杨宝峰院士/杜伟杰教授团队在 Signal Transduction and Targeted Therapy 发表了题为「Exosomes secreted from cardiomyocytes suppress the sensitivity of tumor ferroptosis in ischemic heart failure」的研究论文，该研究发现心肌梗死引起的心衰降低了肿瘤对铁死亡诱导剂的敏感性。首先，作者构建了心衰小鼠模型，并给 Sham 小鼠和MI小鼠接种肿瘤，结果心衰加速了肿瘤的生长，这与研究报道相符。此外，作者对 Sham 和MI小鼠接种肿瘤后用 Era

南京大学医学院附属鼓楼医院内分泌科毕艳教授团队和南京大学生命科学学院张辰宇、李靓教授团队合作，首次发现外泌体可介导脂肪-大脑间通讯并促进糖尿病认知功能障碍的发生。研究成果发表在国际著名期刊《Cell Metabolism》上。研究背景：糖尿病显著增加认知障碍的发生风险，严重影响老年人健康生存状态。临床研究表明控制血糖不能保护认知功能，因此需要进一步揭示糖尿病认知功能障碍的机制，寻找治疗糖尿病认知障碍的新策略。脂肪组织外泌体作为新型脂肪因子，可参与脂肪组织与其他外周组织器官间的生物信号传递以及代谢调控，但能否介导脂肪组织与大脑信息交流的发生尚不明确。研究结果：作者利用脂肪移植和多种外泌体示踪技术，发现肝脏来源的细胞外囊泡（EVs）不能介导外周组织和大脑间通讯，而脂肪组织来源的 EVs 是形成二者通讯的重要生物学介质；在胰岛素抵抗及糖尿病状态下，脂肪组织 EVs 携带的内容物 miRNAs 促进海马突触丢失和认知功能损伤。研究团队进一步利用小 RNA 测序和转录组测序技术，识别了脂肪组织来源的EVs中造成糖尿病认知功能损伤的系列关键分子，发现人和小鼠共有的致病分子 miR-9-3p 通过靶

外泌体是由细胞分泌的包含 RNA 和蛋白质的小囊泡（30～150 nm），它可将源自亲代细胞的特定物质递送至疾病发展相关的受体细胞，因此一直被认为可作为疾病进展的潜在生物标志物用于诊断，但具体机制仍不清楚。外泌体 RNA 作为癌症诊断标志物是否可行？CircLPAR1 是外泌体中的环状 RNA 分子，在结直肠癌（CRC）患者血浆外泌体中会发生显著变化。南京医科大学团队在Molecular cancer发文[1]，通过对 CRC 特异性的外泌体 circRNA 进行鉴定和富集，最后使用 qPCR 检测后进行功能评估。本研究对血浆外泌体 circLPAR1 可作为 CRC 高灵敏早期诊断标志物提供了新的证据。qPCR 检测外泌体是强强联手还是无稽之谈？我们也许会有疑问：外泌体本来就少，提取的 RNA 就更少，后续做 qPCR 检测岂不是难上加难？想知道 qPCR 检测外泌体是否具有合理性，我们需要先了解如何进行这项实验。实验过程：1）外泌体提取包括 Umibio 在内的很多公司都有针对各种不同样本的外泌体提取试剂盒。样本预处理阶段很重要，甚至决定了后续提取外泌体的纯度和量。2）RNA 提取

TEM 透射电镜是外泌体鉴定的金标准，对于所有做外泌体的朋友们来说，是必经之路，基于很多老师们的呼声，我们的研究人员，经过细致化整理，把所有的操作过程都整理出来，供各位参考，经验有限，有不当之处，还请多多沟通。一、首先，我们看看电镜的原理是啥？然后，电镜的结构也是比较复杂的！二、那么，我们看看样品有哪些要求？样品要求：1、能被电子束穿透（薄）2、耐电子束轰击3、有磁性的样品不可以放置4、长纤维样品若需上样需加盖铜网三、接下来，我们看看规范化拍摄 Umibio 是怎么操作的？声明：本次操作基于我司最近正在使用的 HT7700；1、送样要求：样品尽可能浓，颗粒浓度 1.0E+10；2、拍摄规范：样品以茶托状（有明显凹陷的）球形，椭球形或扁圆形，尺寸在 30-150nm，有双层膜结构的颗粒为目标进行拍摄；照片以轮廓清晰，分辨率高，焦距合适（既没有过焦的虚影，也没有欠焦的黑边），背景杂质少，明暗适宜，颗粒居中，整体美观为佳；默认拍摄 100nm 一张，200nm 三张，500nm 一张；注：铜网中样品焦距无法调清时以调试后的最佳结果拍摄，样品中无特征明显的颗粒或无颗粒时，拍摄 500nm 的样

首先，我们先看原理：纳米颗粒示踪分析仪(NTA)利用光散射和布朗运动的属性，以获得液体悬浮液中样品的粒径分布。颗粒的运动速度和其粒径有着直接的关联；此技术观测的是颗粒的散射光斑，而不是颗粒本身； 「眼见为实」,确保分析的是目标颗粒而不是背景颗粒或噪音。然后，我们看下设备介绍：（声明：本次操作基于最近正在使用的 NS300。）然后，我们看下具体是如何操作的：开机→清洗→上样→设置参数→调整视野→设置保存路径→检测 →仪器自动分析结果→出报告→保存后下样关机说明：散射光模式与荧光检测模式的步骤差别只有设置的参数不同，其余步骤一致，输出的报告格式也一致；1、 开机；2、打开电脑显示屏上的软件系统；3、注射器吸稀释液打入管路，清洗残留，再打入空气去除稀释液。用稀释液清洗盖板与激光器接触面，用无尘纸擦干；4、安装盖板，螺丝固定（对角线）；5、用注射器（查看是否有气泡）将试剂样注入样品池，椭圆形镜片观察到液面全覆盖即可；6、激光器推入仪器，滑轨到底，绿灯亮时转上红色开关（位置正确时，开关转的很轻松）；7、设置参数，Screen Gain（屏幕增益）和 Camera level（相机级别），一般 4

实验目的：通过 DIR 染料标记外泌体，通过尾静脉注射 DIR-labeled Exosome，24 小时内观察外泌体在体内的代谢情况。实验材料：DIR- Exosome，裸鼠；DIR-Exosome：染料终浓度 1uM，外泌体 200ug，体积 200ul；Exosome 来自 HEK293 无血清培养基（Umibio，UR51102）条件下获得，通过外泌体提取试剂盒提取（Umibio，UR52121）。实验内容：1、通过尾静脉注射 200 ug/支的 DIR- Exosome 到裸鼠体内；Day 1， AM：8：00 注射；2、 小动物活体成像观察：Day 1， PM：16: 00 小动物活体成像观察，全身和颅内（重点）。Day 2， AM：8：00 小动物活体成像观察，全身和颅内（重点）。Day 3， AM：8：00 小动物活体成像观察，全身和颅内（重点）。48 小时成像结束后，实验结束。实验结果：1、尾静脉注射 DIR-Exosome 8 小时后，小动物活体成像检测：2、尾静脉注射 DIR-Exosome 24 小时后，小动物活体成像检测：3、尾静脉注射 DIR-Exosome