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通过本视频，您将了解到不同蛋白标签的特点，也将学习带有不同标签的重组蛋白的层析纯化策略与方法。

纯化达人成长记之凝胶过滤实验的层析原理解析，帮助您更好地理解不同的凝聚过滤应用，解答您在凝聚过滤实验中的常见问题。

在掌握各类层析技术的原理、实验步骤、常见应用及成功技巧的基础上，通过科学设计纯化流程，可以在确保高纯度样品的同时兼顾回收率，详见 CIPP 纯化三部曲的精细解读。

‌FcR阻断剂，‌让流式实验中的干扰无处遁形说到Fc阻断，就不得不提到抗体。抗体的结构分为Fab和Fc段，Fab段是与目标分子特异性结合的区域，Fc段是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位[1]（图1）。Fc受体（Fragment Crystallizable Receptor，FcR）是免疫调节受体中非常重要的受体，主要在先天免疫细胞上表达，能被抗体的Fc段识别并结合，从而引发免疫应答。图1：抗体结构为什么要做Fc阻断?在细胞学实验中，正确区分阳性和阴性细胞十分重要。获得良好的阳性细胞群，得益于抗体的特异性结合，但是多数免疫细胞表面都会表达FcR，并且与抗体的Fc段有不同程度的亲和力。因此，抗体Fc段会非特异结合细胞FcR（图2），在流式图中便会出现一群本不应该存在的非特异性细胞群（图3）。值得注意的是，这种非特异性结合的信号，并不会因为同型对照的使用而被扣除掉，容易导致在流式分析中出现背景增高甚至假阳性信号的结果。图2：抗体与细胞结合的示意图图3：FcR block流图对比哪些实验需要考虑Fc阻断？从广义上来讲，任何涉及抗原抗体反应的实验，涉及到的细胞类型表达FcR，同时反应抗体含

低至单个细胞的DNA/RNA共提取方案，起始样本支持显微切割细胞、流式分选细胞、循环肿瘤细胞（CTCs）、胎儿细胞、干细胞、T细胞等。

研究背景 使用程序性死亡-1抑制剂或其配体（抗PD-1/PD-L1）的免疫检查点阻断 (ICB) 疗法已成为治疗许多癌症的有效方法。然而仅有少数患者对ICB疗法表现出长期良好的反应，大多数患者对免疫检查点阻断剂都没有阳性反应或因为阻断剂的不良反应而不得不停止服用。虽然已经发现了许多类别的生物标志物，但目前仍未发现强有力的治疗反应预测标志物。寻求新的ICB反应的非侵入性生物标志物能大大提高ICB疗法的临床效果。研究内容及结果 2020年9月，在Nature子刊Nature Cancer(IF=23.5/中科院一区)杂志上发表的题为 Personalized circulating tumor DNA analysis as a predictive biomarker in solid tumor patients treated with pembrolizumab的研究成果发现肿瘤释放到血液中的循环肿瘤DNA（ctDNA）的水平变化能够预测患者的免疫治疗疗效[1]。这项发现无疑为免疫治疗打开了新的突破口。该研究团队发起了一项包括头颈部鳞状细胞癌 (SCCHN)、三阴性乳腺癌 (TNB

低至单个细胞的DNA&mRNA共提取方案，起始样本支持显微切割细胞、流式分选细胞、循环肿瘤细胞（CTCs）、胎儿细胞、干细胞、T细胞等。

荧光定量PCR 技术可以实现RNA 的相对定量，广泛应用于分子生物学研究及疾病相关研究。QIAGEN QuantiNova PCR系列可支持包括一步法、多重等多种qPCR应用；超快速的反应体系30min即可完成实验及独特的颜色指示方案杜绝加样错误；LNA（锁核酸）技术加持增强引物或探针的灵敏度和特异性。

环境核酸是生物与环境互作遗留的核酸，来源包括生物脱落的组织、分泌物、排泄物、血液或尸体等，分布在各种水体、土壤、沉积物或空气等环境中，是微生物和脱落DNA的混合物,这两类核酸在上述环境样本中存在较少。

从微量样本中分离 RNA，微量样本包括：微量细胞样本如低至 1 个细胞、流式分选细胞（FACS）样本；微量组织样本如低于2 μg的组织样本如穿刺样本（FNA）、激光显微切割（LMD）样本等。

从微量样本中提取DNA。微量样本包括：微量血液样本，如低至1 μl全血；微量细胞样本，可低至100个细胞，如显微切割细胞、流式分选细胞等；或小于10 mg组织，如穿刺样本、活检样本；以及骨骼或化石等疑难样本。

RNA测序 (RNA Sequencing，简称RNA-Seq) ，是基于高通量测序技术的转录组学研究方法，可以快速对基因组中的RNA种类和数量进行分析，揭示特定生物学或疾病发生过程中的分子机制。

很多研究人员面对不足1 ng的样本往往束手无策，实际上随着生物技术和酶活性的进步，目前的技术已经可以针对10 pg样本进行全基因组建库（如需对DNA进行打断则最低起始量为20 pg）。

游离核酸 （包括cfDNA和cfRNA) 是指在生物体液中发现的游离于细胞外的核酸，游离核酸的来源分为内源性和外源性，可以是细胞凋亡释放到体液中的内源性核酸，也可以是人体感染病原微生物后由微生物产生的外源性核酸。游离核酸可以用于癌症的早期诊断、预后评估，也可以用于病原感染的诊断，根据实验目的不同，采集体液样本类型不同，核酸纯化方案也有一定区别。

单细胞测序可以研究单个细胞内的基因情况，同时解决了用组织样本测序无法解决的细胞异质性难题。但是我们常提到的单细胞测序方案并不是仅对单个或者几个细胞进行测序，而是在单细胞分辨率下对成千上万个细胞进行测序。那么如果真的只有一个细胞或极微量的核酸，又该采用什么手段对其基因组和转录组进行分析呢？单细胞/微量核酸扩增方案可以富集核酸样本，应对后续各种分子研究。

研究背景 从2009年到2023年，世界卫生组织已经发布了7项国际关注的突发公共卫生事件（PHEIC）宣言，大约每2到3年发生一次严重的新发传染病疫情。及时和准确的监测工具对于监测病毒传播模式以及针对这些新出现的传染病采取有效的公共卫生干预措施至关重要。在新冠肺炎大流行期间，废水监测被证明是一种有效的工具，可以反映感染趋势，比传统临床监测更早地识别新出现的病毒变种。在后COVID-19时代，迫切需要在这一实际经验的基础上更广泛地应用废水监测，特别是对地方病和新出现的传染病进行更全面的监测。研究内容及结果 2024年5月15日，香港大学环境工程研究中心的研究人员在Water Research(IF=11.4/中科院一区)杂志上发表题为 Tracking diarrhea viruses and mpox virus using the wastewater surveillance network in Hong Kong的研究成果[1]。在这项研究中，研究者们建立并验证了废水中病毒的检测方法。研究者们开发了一种基于上清液的方法来检测废水样本中的 RNA 病毒，并将其应用于全市污水处理厂

研究背景 癌细胞因其基因组不稳定，导致单核苷酸变异和拷贝数改变在癌细胞中积累。对整个基因组中特定核苷酸替换的流行率的研究表明细胞暴露的突变过程会留下痕迹，称为突变标志。针对不同癌症的大规模基因组测序工作已经确定了50多个突变信号，掌握这些突变信号将提高我们对作用于癌症基因组的细胞缺陷以及其在正常组织中的理解。此外，突变信号可以用于患者分层来帮助临床医生定制疗法，也可以利用这些特定缺陷，改善早期检测和癌症预防策略。然而肿瘤基因组中的突变特征通常来自全基因组测序（WGS）。由于相关的测序成本，WGS通常仅限于使用少量高质量样本的研究。因此，寻找一种成本效益高、可扩展的用于少量DNA的低质量样本的检测方法就显得尤为重要。研究内容及结果 2020年6月23日，英国剑桥大学癌症研究所的研究人员在Nature子刊Nature Communications(IF=14.7/中科院一区)杂志上发表题为 The mutREAD method detects mutational signatures from low quantities of cancer DNA的研究成果[1]。研究者们提出了一种基

研究背景 尿路感染（UTI）是最常见的感染之一，每年影响全球1.5亿人。尿路感染最常见的原因是粪便中的病原体（主要是大肠杆菌）沿尿道上升并感染膀胱。病原培养是诊断尿路感染的金标准。然而，培养通常很耗时，检测率低，诊断准确性有限，尤其是在服用抗生素的患者中。一部分患者在经过治疗后仍会出现慢性尿路刺激症状和尿液分析结果异常，干扰了正常生活。由于严重滥用抗生素，致病菌的耐药性急剧增加，进一步加重了疾病负担。因此，快速准确地鉴定病原体、专业解读和靶向治疗是UTI临床诊断和治疗的关键。研究内容及结果 2023年3月3日，天津医科大学第二医院的研究团队在Frontiers in Cellular and Infection Microbilogy(IF=4.6/中科院二区)杂志上发表题为 Enhancing urinary tract infection diagnosis for negative culture patients with metagenomic next-generation sequencing (mNGS)的研究成果[1]。宏基因组下一代测序（mNGS）是一种新兴的病原体

研究背景肝细胞癌（HCC）被认为是中国癌症相关死亡率的第三大原因。尽管手术是治疗HCC的较佳选择，但由于缺乏早期症状，大多数患者在癌症晚期才被诊断出来，因此肿瘤复发的风险很高。识别可能复发的患者并给予对应的辅助治疗，仍然是一个临床难题。循环肿瘤DNA（ctDNA），也可称为肿瘤衍生的细胞游离DNA，包含有关肿瘤基因组图谱的全面信息，包括单核苷酸变异（SNVs）、拷贝数变异（CNVs）和表观遗传变异。将ctDNA与HCC中的传统血清蛋白生物标志物结合将为无创监测实时肿瘤进展提供新的可能。研究内容及结果2019年9月3日，福建医科大学孟超肝胆医院的科研团队在Clinical Cancer Research(IF=10/中科院一区)杂志上发表题为 Comprehensive Liquid Profiling of Circulating Tumor DNA and Protein Biomarkers in Long-Term Follow-Up Patients with Hepatocellular Carcinoma的研究成果[1]。在这项研究中，研究人员使用基于个性化肿瘤分析和低覆盖

患者活检或手术标本的研究对于阐明疾病尤其肿瘤的发病机制、指导治疗方案来说非常重要。但是活体组织一旦离体，血氧供应停止，就会产生一系列生物化学和组织形态学的改变，直至发生自溶，干缩，腐败，核酸和蛋白也会迅速降解，因此需要及时固定。福尔马林固定、石蜡包埋 (Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded, FFPE) 技术能够在组织离体后最大程度地保存其原有的形态学结构及生物学信息，成为肿瘤研究领域中疾病诊断和科学研究中非常常见的生物学材料。在分子病理学高速发展的今天，研究人员能够从FFPE样本中获取更多有用的信息，挖掘其潜在的临床价值。然而一些大型临床项目的时间跨度有时会长达5—6年甚至更久，FFPE样本就成为很好的生物信息存储载体，为了能够充分挖掘FFPE样本中的生物学信息，我们不仅需要关注核酸提取的步骤，福尔马林固定及石蜡包埋等标本前处理过程更加不容忽视。标本前期处理的规范化、标准化流程是后期各项检测关键的第一步，也是首要环节，是后期各项技术的保证。下面为您分享标本前处理的注意事项。标本的前处理过程包括：标本固定标本固定是组织处理最重要的一步，也是最无法补救