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我做 western 的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份 western blot 操作步骤，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献。我按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的 western 条带了，所以相信你也行。背景蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学 George Stark。Neal Burnette 于 1981 年所著的 Analyt ...

有不少人询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用 BLAST 进行序列比对...... 其实这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。我将结合我自己使用 NCBI 的一些经历跟大家交流一下 NCBI 的使用。主要有以下四部分内容：如何查找基因序列、mRNA、Promoter如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列运用 STS 查找已经公布的引物序列如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性今天我们就先讲第一部分：如何查找基因序列、mRNA、Pro ...

养细胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顾小孩一样仔细对待，爱护她，呵护她。上篇提到细胞培养的注意事项（点此蓝色字体查看），反响热烈，这次就来讲讲细胞培养常见问题的原因及对策。1 培养液 pH 值变化太快 原因CO2 张力不对培养瓶盖拧得太紧NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足培养液中盐浓度不正确细菌、酵母或真菌污染 对策按培养液中 NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内 CO2 浓度，2.0 g/L 到 3.7 g/L 浓度 NaHCO3 对应 CO2 浓度为 5％ 到 10％。或者改用不依赖 CO2 培养液松开瓶盖 1/4 圈加 H ...

在免疫荧光染色过程中单染和共染是常用的两种方式，除此之外我们还可能会用到远红外进行染色标记。这相对于前两者实验操作上处理方法是一致的，唯独在样品处理上有所不同，而导致荧光定位标记的颜色增多，相对而言变得复杂。免疫荧光技术主要是通过抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。那么接下来，我们重点来介绍免疫荧光操作方法以及注意事项。操作步骤：1. 首先，在常温下将组织切片用免疫组化笔进行画圈 ...

刚开始做 Western blot 的同学们想必都大多都是研究生，虽然科研经历还不是特别丰富，但情感经历一定都比较丰富吧。同学们想想自己刚谈恋爱的时候，你刚喜欢一个人却还没表白之前，是不是每天都要想尽一切办法了解他 / 她的爱好，他 / 她的习惯，他 / 她每天的路线等等，等你心里有数之后再开始考虑如何表白？做实验也一样，在开始 Western 之前，尽可能多的了解你的目的蛋白，这和谈恋爱一样，这样表白成功的概率才会大大增加。当然，表白失败也很正常，我们之 ...

今天组会后师妹很不开心，因为老板看了她的 western blot 的结果图后一脸严肃的说：你这个差异不明显啊。师妹说怎么就差异不明显了，我觉得挺明显的啊，她凑近电脑屏幕看了看后，又后仰身体拉大了距离进行观察，就差拿尺子来测量条带的长宽了。我被我这可爱的师妹给萌化了，但又不忍心看她愁眉苦脸的样子，于是轻抚摸师妹的秀发，深情的说到：妹妹，给你安利一款软件，轻松搞定 WB 结果表达差异。好了，下面就奉上使用 Gel-Pro Analyzer 对 WB 结果 ...

果蝇，最最经典的模式动物之一，摩尔根爷爷的萌宠。毫不夸张的说，假如没有果蝇的存在，生命科学的研究很难取得现在这样的成就。△ 图片来源：站酷今天生物学霸想和大家聊聊那些有趣的果蝇基因命名。你印象中的基因名字是不是一堆字母和数字不知所云的组合？那么今天了解的这些有趣的基因名字一定会让你感叹：原来科学家也可以这么有意思！・・・ hedgehog为什么叫 hedgehog （刺猬）呢？是因为敲出这个基因后，果蝇胚胎会长出类似毛刺的东西，和 ...

统计图，和科研领域里的大多数图像数据伴生，是一种大家喜闻乐见的，直观表现数据结果的形式。周围的 Lab 不管是做免疫，还是发育，或者肿瘤，都涉及到要做免疫荧光（Immunofluorescence, IF）或者免疫组化（Immunohistochemistry， IHC），而在拍完了图之后，直接给老板 show 漂亮的 images 时并不能让 TA 百分百满意，总是想要一个 bar 图，那就需要统计了。而手动点数细胞太费时，所以向大家介绍一个有用的软件 IMARIS ...

前几天学霸平台有一篇推文《这才是科研狗脱贫的王道》，开篇用一组气势磅礴的排比句道破生物科研狗脱贫的天机 ---- 生物信息学。的确有师姐靠生物信息学发高分文章，也有师兄毕业进华大、博奥、华因康，持股分红薪资强，摇身一变，从此走上人生巅峰。可是，作为科研狗，想要走上人生巅峰，首先你得能毕业。说到生物信息学（bioinformatics），通常在处理高通量数据的过程中，我们往往需要借助一些表达谱信息进行比对分析，通过不同类型样本之 ...

做了 5 年的 MTT 实验 ，耗费了上万块 96 孔板。有成功的喜悦，有失败的沮丧，有好多话要对各位实验同仁说。在这之前，我们先回顾一下 MTT 的原理及操作步骤。实验原理MTT 是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下，生成蓝色的 formazan 结晶。formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原，无法形成结晶），且该结晶溶解于 DMSO。利用酶标仪测定波长 490 nm 处的光密度 OD ...

师姐说：师妹啊，你帮我找几个基因的 qPCR 引物吧。你问怎么找？师姐说查文献啊！于是你一头雾水的开始查文献：打开 Pubmed，输入基因名，ATG7,enter，哇，有几万条记录，点下 best match，再选下近 5 年的文献，筛选一下，哇，还有几万篇相关文章。好吧，那就选第一篇看吧，点进去，找全文，往下拖，找到材料和方法，找啊找，终于找到了，那就 copy。还挺幸运的，可是，一看时间，半个小时过去了，这才查了一个基因的，还有好几个，一个晚上又没了，心里 ...

在我们实验中，养细胞是所有实验的基础，肿瘤细胞培养过程中，总会遇到这样那样的麻烦，以下几种情况，你是否遇到，如何解决，大师兄给你指明一二三。如何判断细胞污染了？状态 1： 细胞培养液变浑浊了，经常见到是米汤样，黄色液体，一般认为细菌污染。状态 2：细胞培养基内含有能动的小黑点，一般认为是黑胶虫。状态 3：胞培养基清亮，但是能看到飘在培养液带有毛毛的白色的菌状物质，有可能就是真菌感染。策略：细胞污染了就直接扔了，还得把培养箱用酒精棉球擦 ...

细胞培养的过程大概是这样的：失败—成功—体味—收获—思考—交流，你到了哪个阶段？不妨和我们一起来看看丁香园上各位站友养细胞的那些事。・・・心肌细胞培养体会记得刚养心肌细胞时候，开始时候很顺利，但有一次突然细胞就不怎么贴壁了，换液时候一吹打，就发现有许多细胞脱落。我检查了培养箱，可是别人的细胞都长的很好，培养基的问题？我仔细观察了一下，培养基粉红透亮，绝对不会污染，血清也没有问题，大家都是公用的血清。当时我很迷惑，后来我向老 ...

实验中发现两个蛋白的表达有调控关系，如何用生信方法确认？以下几步简单粗暴，不得不试 （文字少，全是干图）先看两个蛋白有没有直接相互作用1. 肯定要先试试最著名的 STRING 了。STRING 官网 http://string-db.org。在首页左侧边栏中，选择 Multiple proteins，在右边输入框中输入蛋白名称和研究对象种类。随后不停的 continue，就能看到结果了。根据两个蛋白之间连线的颜色，可以判定两个蛋白的可能相互作用类型（K ...

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）能够快速测定细胞悬液中单个细胞的生物学性质，并可以对特定的细胞进行分选收集。广泛用于细胞生物学，免疫学，遗传学，基础医学等领域。接下来的 Protocol 中以小鼠的淋巴细胞为例进行细胞表面和胞内染色。一. 试剂准备Wash Buffer：PBS+1% FBS破膜剂（ICS）：用双蒸水配置 10 % Saponin（Sigma）。破膜固定剂：将配好的 ICS 用 4% 多聚甲醛稀释 100 倍ICS Wash Buffer：将配好的 ICS 用 W ...

常有人问，动物实验做到最后，才发现自己选错了动物模型，实验功亏一篑，不仅浪费实验经费也浪费时间精力。针对这样的问题，笔者对常见的小鼠品系进行介绍，希望帮助小伙伴们少走弯路。NU 小鼠NU 小鼠通常被称作「InbredNude」，即裸鼠，肿瘤学和免疫学研究中的扛把子。裸鼠无胸腺，缺乏 T 细胞，不能进行细胞免疫，抵抗力极差。想得到稳定的实验结果，饲养环境一定要洁净，强烈推荐 SPF 级的动物房，这样的深宫大院绝对是裸鼠健康生长的不二之选。笔者 ...

RCR 实验，就是检测逆转录病毒的可复制性。刚开始由同事负责这个实验，结果一直问题不断，后来由我接手，从失败到成功，历时两个月，感触颇深！我们检测的是 GALV（gibbon ape leukemia virus）病毒的可复制性，根据现有 paper 中的做法，一是通过 qPCR 检测 GALV 病毒某段特定序列，二是 PG4 细胞空斑实验。1qPCR 方法根据论文中的引物序列我们合成了引物，然后通过 SYBR 法来检测目的基因。一个很简单的 qPCR，看似一切都很正常，然而后续问 ...

最近 WB 的结果趋势不是很理想，因为给了蛋白 B 的抑制剂蛋白 B 却没有明显变化。于是大伙儿一合计，可能需要再看看蛋白质之间的相互作用，会不会是抑制剂影响了蛋白 B 和蛋白 C 之间的结合，而不是直接导致蛋白 B 的降解。大家都知道研究蛋白质相互作用的三大经典方法是：酵母双杂交（Y2 H），免疫共沉淀（CoIP）和 GST pulldown。结合我们课题组的这个实验，因为只需看看蛋白 B 和 C 之间的结合，而且已知蛋白 B 和 C 是会结合的，所以可能用 CoIP 最简便。那么问题来了，实验室里也没人做过 Co ...

不管是临床医生和科研工作者，我觉得二者的共同敌人都是一致的，那就是时间。作为一个临床医生，没（zen）事（me）儿（ke）的（neng）时候搞搞科研，必须想尽一切办法对付（挤出）时间。在开始 WB 之前的蛋白定量耗费时间有点长，如果用 BCA 法的话光孵育就需要半个小时，整个过程耗时接近 1 小时。因此为了配合快速 WB，我们同样需要一个快速蛋白定量的方法。因此今天我们来聊聊如何 1 分钟测出蛋白浓度。蛋白定量法开始之前我们有必要复习一下理论知识。蛋白定 ...

对于养细胞的人来说，可谓是谈 「污」色变，任何时候听见细胞污染晴空万里立马暴风雨，而细胞污染又是养细胞过程中，尤其是新手经常遇到的问题。 细胞污染是一个很广的范围，微生物的种类更是各种各样，不同的污染的原因不同处理也不同，因此掌握对常见细胞污染的识别至关重要。 自己也是从刚开始养细胞 3 天一个小污染 7 天一个大污染过来，也积累了些经验，自己整理归纳了一下，希望对养细胞的同学有所帮助。