人源肿瘤组织样本制备高质量肿瘤细胞

gentleMACS 解离仪器通过机械解离联合酶消化（降解细胞外基质），将人源肿瘤组织温和、快速且高效地制备成单细胞悬液，同时保留细胞表面表位。获得的高活率单细胞可用于后续细胞分选、培养、表型分析或功能/基因组/蛋白质组学研究。

1. 酶溶液复溶：

Enzyme H：每瓶冻干粉加入 3 mL  RPMI 1640 或 DMEM 复溶。分装后 –20 °C 保存。若后续用于细胞培养，复溶后需先经无菌过滤再分装。

Enzyme R：每瓶冻干粉加入 2.7 mL RPMI 1640 或 DMEM 复溶。分装后 –20 °C 保存。

注：使用前须充分混匀该悬浊液！

Enzyme A：每瓶冻干粉加入 1 mL 无菌去离子水复溶。勿涡旋。分装后 –20 °C 保存

2. 酶混合液制备：

按肿瘤大小，于 gentleMACS C 管中配制酶混合液，见下表：

注：若重点分析肿瘤浸润白细胞（TILs），建议将 Enzyme R 用量减至 20 %（>0.2 g 样本加 20 µL，<0.2 g 样本加 10 µL）。减少酶 R 有助于保留细胞表面表位，但可能降低内皮细胞、上皮细胞及肿瘤相关成纤维细胞 (TAFs) 的得率与活性。

3. 组织准备：

去除肿瘤样本中的脂肪、纤维及坏死区域。将肿瘤切成 2–4 mm 小块，若活检组织极小，可根据长度切成 2–4 片。将组织块转入已含酶混合液的 gentleMACS C 管。拧紧 C 管盖子，将其倒置插入 gentleMACS 解离通道中（确保组织位于转子和定子之间的作用区域）

4. 组织解离：

根据肿瘤组织学组成，可将肿瘤组织分为软、中、硬三类。常见人肿瘤类型示例见下表：

使用 gentleMACS Octo 八通道带加热全自动组织解离器进行解离：
（1）按下表选择合适 gentleMACS 程序，运行程序，结束后转到 4.2 节第（2）程序结束后取下 C 管。

注：对于硬肿瘤，可能仍有较大组织块残留。为获得更高细胞得率：
a) 静置使组织块沉降，将上清转移至新管；
b) 向残留组织的 C 管中加入 RPMI 1640 或 DMEM（>0.2 g 样本加 4 mL；<0.2 g 样本加 2 mL）；
c) 将 C 管再次固定于解离仪上，运行程序m_imptumor_01；
d) 将所得细胞悬液与之前转移的上清合并。

（2）（可选）短暂离心，使样本聚集于管底。

（3）重悬样本，并将细胞悬液过 30 µm 或 70 µm 细胞滤筛（置于 50  mL 管上）。

（4）用 20 mL RPMI 1640 或 DMEM 冲洗滤网。

（5）300 × g 离心 7 分钟，弃上清。

（6）（可选）若解离后样本黏稠（提示 DNA 释放）：

• 300 × g 离心 5 分钟，彻底弃上清；
• 用 5 mL RPMI 1640 或 DMEM 重悬沉淀；
• 加入 200 U/mL DNase I，室温孵育 5 分钟；
• 用 5 mL 含血清缓冲液 300 × g 离心 5 分钟洗涤；
• 彻底弃上清后，用 RPMI  1640 或 DMEM 重悬。

（7）根据下游实验需求重悬细胞。

（8）（可选）使用人源细胞悬液净化试剂盒（130-135-177）去除红细胞、死细胞及游离细胞器。

（9）（可选）若碎片过多，可使用碎片去除溶液（130-109-398）。

注：若使用无加热模块的 gentleMACS 组织解离器进行解离，可参考试剂盒 datasheet 对应部分操作。