小鼠大脑组织制备高质量神经细胞

gentleMACS 解离仪器通过机械解离联合酶消化（降解细胞外基质），将新生（≤P7）小鼠脑组织高效、温和地制备为单细胞悬液，同时保留细胞表面表位。所得细胞可立即用于 MACS^® 磁珠分选、体外培养、流式/荧光表型分析、RNA/蛋白组学（如单细胞测序）。

注：神经组织解离试剂盒根据不同的酶分为 P 型（130-092-628）和 T 型（130-093-231），后文分别用缩写 NTDK（P）和 NTDK（T）指代。

1. 酶溶液复溶：

Enzyme P：NTDK（P）独有，即用型液体，-20 °C 分装保存 6 个月。

Enzyme T：NTDK（T）独有，冻干粉 + 3 mL Buffer X 复溶，轻柔颠倒混匀（勿涡旋），-20 °C 分装保存 6 个月。

Enzyme A：冻干粉+ 1 mL 无菌水复溶（勿涡旋），-20 °C 分装保 6 个月。

2. 酶混合液制备：

以上体积适用于 ≤400 mg 组织。若 >400 mg，需等比例放大试剂体积，单管最大 1600 mg 小鼠脑。

3. 组织解离：

使用 gentleMACS Octo 八通道带加热全自动组织解离器进行解离

（1）取脑：剥离新生小鼠脑组织，HBSS(w/o) 中称重（约 1 mL）。

（2）加酶 Mix 1:1950 μL Enzyme Mix 1 加入 gentleMACS C 管。

（3）转移组织：将脑组织移入含酶液的 C 管。

（4）加酶 Mix 2：再加入 30 μL  Enzyme Mix 2（无需预混）。

（5）固定：拧紧 C 管盖子，将其倒置插入 gentleMACS 解离通道中（确保组织位于转子和定子之间的作用区域）。

（6）运行程序：执行 37C_NTDK_1（自动加热 + 机械解离）。

（7）终止：取下 C 管，短暂离心使样本聚集于管底，随后重悬样本。

（8）过滤：将 70  μm 细胞滤筛（缓冲液预湿）置于 50 mL 管上，将细胞悬液过筛，随后添加 10 mL HBSS（w）冲洗。

注：每管≤400 mg 脑组织，单滤网可处理≤2 mL。若放大体系（>400 mg）需增加滤网，用 5 倍酶溶液体积的 HBSS（w）冲洗，必要时拆分样本。此外，直径>70 μm 的细胞可能丢失，如需保留请改用更大孔径滤网。

（9）离心：将过滤后的细胞悬液室温 300×g，离心 10 min，弃上清。

（10）重悬：用适当缓冲液重悬细胞致所需浓度和体积，随后用于下游实验。

注：若沉淀松散，每 mL 悬液补加 30 μL Enzyme Mix 2，37 °C 孵育≥5 min 后再离心。

（11）细胞应立即用于后续实验，以保证最佳活性与表位完整性。

注：若使用无加热模块的 gentleMACS 组织解离器进行解离，可参考试剂盒 datasheet 对应部分操作。