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        溴化乙锭法

        相关实验:DNA 浓度和纯度的测定

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 江佳红硕士

        生物物理学 大连海事大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 于涛博士

        生物化学分子生物 中国科学院大学

        原理

        溴化乙锭(EB)是一种嵌入型染料,其上的一个菲啶环可插入到 DNA 或 RNA 链的堆积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。

        DNA 吸收 254 nm 的紫外辐射并传递能量给 EB,而 EB 本身在 302 nm 和 366 nm 处有光吸收。吸收的能量在 590 nm 处释放,并表现为橙红色荧光。结合的EB的荧光产率远大于游离 EB 的荧光产率。

        EB 结合量的多少与 DNA 的大小和构型有关,而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。对于单一构型的同种 DNA 样品来说,溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的 DNA 含量成正比。

        材料与仪器

        标准 DNA 样品(已知浓度的线性化 DNA,以 TAE 稀释为梯度浓度的一系列标准样品)

        质粒 DNA 的酶切样品(待测)

        溴化乙锭 EB 5 μg/ml(用 PH 8.0的 TAE 稀释 10 mg/ml 母液制备而成)

        紫外透射仪

        步骤

        1、在黑色塑料板上点两排溴化乙锭 2 μl 液滴,每排六点。

        2、取标准样品 2 μl 与第一排溴化乙锭混匀,使各点的 DNA 浓度分别为 20、15、10、5、2、1(单位:ng/μl)。

        3、取待测样品经过梯度稀释后,各加 2 μl 于第二排的溴化乙锭上混匀。

        4、把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上,关好样品室门。以短波紫外光激发荧光,观察每一点的荧光强度或拍照。

        5、比较上下两排的亮度,确定待测样品的浓度。

        注意事项

        1、标准样品含单一种类的 DNA,且大小与待测样品相近。

        2、待测样品和标准样品使用同样的体积。

        3、EB 具有中度毒性、强致癌性,操作时切记戴手套,切勿沾染到衣物、皮肤、眼晴、口鼻等。

        4、沾有 EB 的用具使用完毕统一集中于回收容器中,经净化处理后方可弃。

        5、该方法只能估计样品 DNA 浓度,无法得到具体浓度,更推荐使用 Nanodrop 2000 测定 DNA 浓度。

        常见问题

        1. 如何选择合适的标准样品大小?

        答:通过预实验,选择大梯度标准样品估计待测样品大致大小,再缩小标准样品梯度进行正式实验。

        来源:丁香实验

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