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        MTT 法检测药物对细菌的半抑制浓度

        相关实验:药物敏感性试验

        别名:MTT 药物敏感性实验

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 薛梦瑶博士

        植物病理学 中国农业大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 刘建敏博士

        病理学与病理生理 中国科学院大学

        简介

        MTT 又名噻唑蓝【3-(4 ,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2, 5-Diphenyl Tetrazolium Bromide,中文名为 3-(4, 5-二甲基-2-噻唑)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐,商品名为噻唑蓝】,是一种黄颜色染料,可用于检测细胞的存活和生长情况。

        原理

        活细胞线粒体中(原核细胞则位于细胞膜上)的琥珀酸脱氢酶 (Succinate dehydrogenase) 能够将外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜 (Formazan) 并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。

        二甲基亚砜 (Dimethyl sulfoxide, DMSO) 能够溶解细胞中的甲瓒,用酶标仪在 490 nm 波长处测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT 结晶形成的量与活细胞数成正比,可以间接反映活细胞的数量,定量评价供试药物的毒性。根据检测数据,计算可得供试药物对细胞的半抑制浓度。

        用途

        广泛应用于药物对体外培养的细胞毒性的测定。

        材料与仪器

        试剂:

        MTT(噻唑蓝)、LA 平板

        LB 液体培养基、PBS、DMSO 等

         

        供试菌株和待测样品:

        大肠杆菌 (Escherichia coli)

        枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 

        待测药物、硫酸链霉素(阳性对照)

         

        实验器材:

        2 mL 离心管、50 mL 离心管、96 孔板

        10 μL 移液枪、200 μL 移液枪

        1000 μL 移液枪、10 μL 枪头

        200 μL 枪头、1000 μL 枪头

        血球计数板、离心管架、恒温震荡摇床

        石英比色皿、酶标仪

        多通道移液器(排枪)等

        步骤

        待测药物对细菌的细胞毒活性检测(以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为例)的步骤如下:

        (1)配制 MTT 和梯度浓度的药物:

        a. PBS 磷酸缓冲液 (1 L,调节 pH = 7.4)

        试剂 用量 (g)
        KCl 0.2
        NaCl 8
        Na2HPO4 1.44
        KH2PO4 0.24

        b. MTT (5 mg/mL):称取 MTT 0.5 g,溶于 100 mL PBS 中,0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌,4 ℃ 避光保存;

        c. 待测药物:称取约 0.5 mg 待测药物,用 DMSO 配成 2.56 mg/mL 的初始浓度,建议预实验稀释的系列梯度浓度分别为 2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02 mg/mL(该浓度范围仅供参考,具体药物浓度请根据自身实际情况进行设立),后根据实验结果再选择更精细的浓度;硫酸链霉素的浓度与待测药物一致。

        (2)绘制标准曲线:

        a. 菌种活化:取相应的斜面菌种各 1 支,无菌挑取、划线接入 LA 平板,37 ℃ 黑暗倒置培养 12~14 h;

        b. 菌种培养:确定细菌在平板上生长状态无误后,接入 LB 液体培养基中,37 ℃ 、180 rpm 摇培 12~14 h 至浑浊;

        c. 接种、孵育和检测:分别吸取 1 mL 菌液至 20 mL LB液体培养基中,混匀后 37 ℃、180 rpm 摇培,依次按时间取出摇培 0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20 h 的菌液,紫外分光光度计在 600 nm 波长处测定菌液的OD值;

        d. 绘制曲线:将所测得的一组 OD 值为纵坐标、时间为横坐标,绘制出该菌的生长曲线。

        (3)培养靶标细菌:活化靶标细菌,并将活化好的靶标细菌接入 LB 液体培养基中,紫外分光光度计在 600 nm 波长处测定菌液的 OD 值,按照标曲在超净工作台内将其稀释至 1×106 CFU/mL;

        (4)共培养:超净工作台内,在无菌的 96 孔板中的每个小孔中加入 95 μL 稀释好的菌液和 5 μL 待测药物,溶剂对照为 DMSO,阳性对照为硫酸链霉素溶液,每个处理重复 3 次,混合均匀后 37 ℃ 静置培养 16~18 h;

        (5)检测:向 96 孔板的小孔内加入 10 μL MTT 溶液,常温显色 4 h 后肉眼观察其 MIC 值(最小抑菌浓度)。

        将产生沉淀的 96 孔 板,在 1500 g 离心 20 min,弃去上清,每孔加入 150 μL 的 DMSO,摇板上振荡 30 min 终止反应并充分溶解沉淀。用酶标仪检测在 490 nm 波长处各孔的吸光值。

        这里半抑制浓度采用改良寇式法进行计算,公式:

        (6)1 g IC50 = Xm-I [P -(3 - Pm - Pn)/ 4]

        Xm:1g 最大剂量

        I:1g(最大剂量/相临剂量)

        P:阳性反应率之和

        Pm:最大阳性反应率

        Pn:最小阳性反应率

        其中,最大阳性反应率是指最大抑制率,最小阳性反应率是指最小抑制率,药物抑制率 = 1 - 加药组 OD 值 / 对照组 OD 值,将所得数据代数计算即可。

        注意事项

        1)MTT 建议现配现用,分装后 -20 ℃ 避光保存,若已经变为灰绿色,则不建议继续使用;

        2)96 孔板最边缘小孔中的水分蒸发很快,容易导致药物浓度变化,出现误差较大,建议边缘小孔用无菌 PBS 填充;

        3)反应结束后需要完全弃去小孔中的液体,本方法中的建议是用移液枪吸取,也可以倒扣 96 孔板用吸水纸吸去液体,两种方法均须注意不要碰到小孔底的沉淀物。

        常见问题

        对于未知药物,加入 MTT 前需确认该药物是否会与 MTT 反应,或本身具有较强的氧化还原性。如果该药物成分尚未得到明确鉴定,建议用 PBS 清洗 2~3 次后再补加培养基,之后再加 MTT 溶液。

        来源:丁香实验

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