小鼠超氧化物歧化酶（SOD）测定——ELISA 法

小鼠 SOD 测定采用酶联免疫吸附试验（ELISA）。通过双抗体一步夹心法，在包被 SOD 抗体的 96 孔板中，加入标本、标准品、HRP 标记的检测抗体，通过恒温培养箱温育并彻底洗涤。

加入底物 TMB 显色，TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 SOD 正相关，用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1、样品收集及处理

小鼠血清：使用不含热源和内毒素的试管，收集血液后，于 3 000 rpm/min 离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

血浆：用肝素钠润湿洁净的 EP 管，收集血液，3 000 rpm/min 离心 10 分钟后，小心收集上清。

组织匀浆：取小鼠组织，加入适量生理盐水捣碎，3 000 转离心 10 分钟取上清。

细胞培养上清：1）检测分泌型因子，收集细胞上清，2 000~3 000 rpm/min 离心 20 分钟后收集上清；2）检测细胞内的因子，用液氮反复冻融细胞促使细胞破坏并释放出细胞内因子。2 000~3 000 rpm/min 离心 20 分钟，收集上清。

如不及时检测，冻存于 -20 ℃ 时，要检测时在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

2、试剂盒保存

小鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 检测试剂盒保存在 2~8 ℃，使用前室温平衡 20 分钟。

3、试剂准备

按试剂盒说明书配制洗涤缓冲液按 1 :20 稀释，即 1 份 20 x 洗涤缓冲液加 19 份的蒸馏水。

4、检测步骤

1）将室温平衡 20 min 后板条取出，剩余自封袋密封放回 4 ℃。

2）设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μL。

3）若检测因子在样本含量过高，则需要稀释样本，即样本孔先加待测样本 10 μL，再加样本稀释液 40 μL；若否，则样本孔先加待测样本 50 μL。空白孔不加。

4）除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入 HRP 标记的检测抗体 100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃ 封恒温箱温育 1 h。

5）弃去液体，在吸水纸上拍干并加洗涤液，静置 1 min，甩去洗涤液后拍干，重复洗板 5 次。

6）每孔加入底物 A、B 各 50 μL，37 ℃ 避光孵育 15 min。

7）每孔加入终止液 50 μL，15 min 内，在 450 nm 波长处测定各孔的 OD 值。

5、结果判断

绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，对应 OD 值做纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1. 样品准备时离心速度大，导致溶血。

2. 检测试剂盒未在室温完全溶解后就使用。

3. 未按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

4. 液体试剂使用前未充分摇匀。