人Toll 样受体 4 (TLR4) 酶联免疫分析

酶联免疫吸附试验，简称 ELISA，是实验室最常用的检测方法。 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有人造催化剂。

ELISA 是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。

因此 ELISA 具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。

应用双抗体夹心法测定标本中人 Toll 样受体 4(TLR-4) 水平。

用纯化的人 TLR4 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 TLR4，再与 HRP 标记的 TLR4 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 TLR4 呈正相关。

用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度 (OD 值)，通过标准曲线计算样品中人 TLR4 浓度。

测定样本中人 TLR4 表达水平。

1、样本前处理：

（1）血清：室温血液自然凝固 10~20 分钟，离心 20 分钟左右（2000~3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

（2）血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10~20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000~3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

（3）组织匀浆：用预冷的 PBS (0.01 M，pH = 7.4) 冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS (一般按 1:9 的重量体积比，比如 1 g 的组织样品对应 9 mL 的 PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂) 加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎。最后将匀浆液 5000x g 离心 5~10 min，取上清检测。

2、实验前准备：

（1）试剂盒室温平衡：使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

（2）选择合适板条数：根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。样本用样本稀释液 1:1 稀释后加入 50 μL 于反应孔内。

（3）若样品中待测物质含量较高，使用稀释液稀释 n 倍（根据预实验选择合适稀释倍数）。

（4）样本编号及微孔条顺序标号。

3、实验步骤

（1）加样：加入稀释好后的标准品 50 μL 于反应孔、加入待测样品 50 μL 于另外的反应孔内。立即加入 50 μL 的生物素标记的抗体。

（2）孵育：盖上膜板，轻轻振荡混匀，37 ℃ 温育 1 小时。

（3）洗板：甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

（4）加酶：每孔加入 80 μL 的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37 ℃ 温育 30 分钟。

（5）洗板：甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

（6）显色：每孔加入显色剂 A、B 各 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃ 避光温育 10 分钟。

（7）终止：取出酶标板，迅速加入 50 μL 终止液。

（8）测 OD 值：加入终止液后，立即测定在 450 nm 波长处测定各孔的 OD 值。

（9）结果分析：使用 ELISACALE 软件制作标准曲线，代入待测物质 OD 值计算出待测物质在样品中的浓度。

（1）试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15~30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存；底物请避光保存；封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染；试剂不同批号组分不得混用。

（2）浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

（3）各步加样均应使用移液枪，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

（4）请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。若标本中待测物质含量过高（待测 OD 值超过标准孔最高 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数 (n 倍) 后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数。

（5）严格按照试剂盒说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

（7）所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

（8）样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于 4℃。若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于 -20 ℃（1 个月内检测），或 -80 ℃（3 个月内检测）, 避免反复冻融。

（9）若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。

（10）若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致 ELISA 测值出现偏差。

（11）选择可靠的试剂盒供应商，根据硕博论文或高水平 SCI 文章中所用相关试剂的厂商选择可靠的试剂盒，以确保实验的准确性及真实性。

（1）标准品不显色或显色弱，样本显色：

解决方式：标准品溶解及倍比稀释时未涡旋振荡或不充分，稀释不正确，试剂体积不够或漏加。

（2）标准品与样本均不显色：

解决方式：孵育阶段抗体抗原之间的接触不充分，导致显色偏弱，建议使用 ELISA 专用的微孔板振荡器，选择合适的振荡频率，以使抗原抗体充分接触，保证结合效果。若排除此原因，排查实验步骤中是否漏加某个组分，如检测抗体、酶等。

（3）标准品与样本均显色，但复孔颜色差别大：

解决方式：这与使用的移液枪及实验者操作有关。移液枪的定期维护及校准是保证实验准确的基础，实验者加样的操作手法练习如加样速度、移液动作等，以确保加样时的准确性。

（4）标准曲线梯度差：

解决方式：吸液或加液不准，标准品稀释不正确或洗涤不完全，建议检查移液枪及枪头，溶解标准品时旋转瓶身，使粉末完全溶解，保证洗涤时间及次数以及每孔的加液体积。

（5）样本待测物质含量较高，无法根据标准曲线测出待测物质在样本中的浓度：

解决方式：建议查阅文献后以小样本进行不同梯度稀释进行预实验，急性计算所得的样本值接近的两个稀释浓度可作为正式试验时的样本稀释倍数。