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        酶联免疫吸附实验

        最新修订时间:

        原理

        利用标记技术将酶标记到抗体(抗原)上,使待检物中相应的抗原(抗体)与酶标记抗体(抗原)发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时,酶能高效、专一催化、分解底物,生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原(抗体)以及量的大小。该方法可对待检样品进行定性和定量分析;同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点,因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。

        目前使用的酶联免疫检测方法很多,其种类按检测目的可分为:
        间接法——用于测定抗体
        双抗体夹心法——主要用于测定大分子抗原
        竞争抑制法——主要用于测定小分子抗原
        本实验以血清 IgE 的检测为例学习双抗体夹心法。

        酶联免疫吸附实验
         
        ELISA 的原理图
         

        材料与仪器

        步骤

        1.  包被酶标反应板

        加 1:500 马抗人IgE 抗体(IgG),0.2 ml/孔。37 ℃ 孵育 2 小时后洗涤3 次,10 分钟/次。


        2.  封闭

        加入 1 %BSA ,0.3 ml/孔,4 ℃过夜。取出,洗涤同上。

         
        3.  待检血清

        加入不同稀释度的待捡血清,0.1 ml/孔。37 ℃孵育 40 min 后,洗涤同上。

         
        4.  酶标记抗体

        加入适当稀释度的酶标抗体,0.1 ml/孔。37 ℃孵育40 min 后, 洗涤同上。

         
        5.  底物

        加入OPD(邻苯二胺)溶液,0.15 ml/孔。室温30 分钟。

         
        6.  终止液

        加入 5N HCI ,0.1 ml/孔。
         
        7.  于 20 min 内,用酶标仪测定各孔OD 值,测定波长495 nm。

        注意事项

        1.  实验时应分别设阳性对照与阴性对照孔,每一待检样品应平行作两份,以保证实验结果的准确性。
         
        2.  实验时,用羊血清、兔血清或BSA 封闭以防止非特异性反应的发生。

        常见问题

        一、实验结果
         
        用待测标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均吸收值的比值(P/N)表示,当P/N 大于某一数值时(如2.1)判断为阳性,数值的大小依具体检测要求而定。

        来源:丁香实验

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