大肠杆菌蛋白表达

大肠杆菌蛋白表达是一种常用的蛋白质表达体系。大肠杆菌是一种常见的细菌，其在生物工程领域中得到了广泛的应用。通过将目的基因插入到大肠杆菌表达载体中，并利用大肠杆菌代谢途径和生理特征，在大肠杆菌中高效表达目的蛋白。

一、转化感受态细胞 BL21（DE3）

1、从−80 ℃ 超低温冰箱中取出 BL21（DE3）感受态细胞放在冰上融化；

2、在超净工作台中取 1 μL 质粒（含目的基因）加到 100 μL BL21（DE3）感受态细胞中，并用移液枪轻轻吹打混匀 (此步骤混匀一定要轻，避免损伤细胞)；

3、将感受态细胞冰浴 30 min 后，42 ℃ 热激 90 s 后再冰浴 2 min；

4、向感受态细胞中加入 900 μL LB 液体培养基（不含抗生素 Kanamycin/Ampicillin），放于恒温振荡培养箱中 37 ℃、 220 rpm 条件下培养 1 h。

二、单克隆培养

1、将经高压蒸汽灭菌锅灭菌的 LB 固体培养基置于超净工作台中冷却，待不烫手时加入抗生素（50 μg/mL Kanamycin/Ampicillin）。取一次性无菌培养皿，将培养基缓慢倾倒至无菌培养皿中央使其铺满无菌培养皿底部，待其冷却凝固；

2、倒入 10 颗左右涂布珠，加 100 μL 转化后的感受态细胞液至培养皿中，将感受态细胞液均匀涂布在培养皿上，放于 37 ℃ 恒温振荡培养箱正置 5 min，使其晾干后倒置培养过夜；

3、第二天，挑取单克隆菌落至 10 mL 无菌的 LB 液体培养基（含抗生素 50 μg/mL Kanamycin/Ampicillin）中，放于恒温振荡培养箱中 37 ℃、220 rpm 条件下过夜培养。

三、菌株扩大培养

1、向 1L 无菌的 LB 液体培养基（含抗生素 50 μg/mL Kanamycin /Ampicillin）中加入 10 mL 过夜培养的菌液（可按此比例选择培养量），放于恒温振荡培养箱 37 ℃、220 rpm 条件下震荡培养；

2、培养 3 h 后从培养瓶中取出 1 mL 培养液，通过紫外分光光度计测定 OD 值，来检测菌种的密度。待 OD600 = 0.6 - 0.8 时，将摇床温度降低至 20 ℃，向菌液中加入 1 mM IPTG 进行诱导，10 h 后离心收集菌体（此步骤中诱导的温度、时间、IPTG 浓度可以根据表达蛋白的不同进行调整），离心后的菌体沉淀 -80 ℃ 保存。

1、感受态细胞应保存在 -80 ℃，不可反复冻融和放置时间过长，否则降低其转化效率。

2、实验操作过程中要保证无菌操作，避免杂菌污染。

3、为了防止单克隆菌落过密，可稀释不同梯度的感受态细胞转化液进行涂板。

4、扩大培养前的菌株最好不要活化太长时间，容易过了对数生长期。

5、分光光度计测定 OD 值时用 LB 液体培养基校准，不要用水，否则误差大。

6、IPTG 诱导的温度、时间、IPTG 的浓度查文献，也可以自己做预实验摸索。因为蛋白的大小、可溶性不一样，所以每个蛋白的实验条件会有差异。

7、保存好每一步的实验材料，如果没有纯出蛋白，可以方便检测，知道是哪一步出了问题，方便下次进行改进。