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        🔥 HIV 耐药检测——PCR 法

        相关实验:🔥 HIV 耐药性检测

        别名:PCR for HIV drug resistance testing

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 徐登高硕士

        细胞生物学 辽宁师范大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 王蕾博士

        生物化学分子生物 浙江大学

        简介

        HIV 耐药性检测可以进行表型或基因型检测,基因型检测是最常用的检测方法,该方法主要是通过 PCR 及基因测序的手段得到 HIV 耐药相关基因序列,分析基因组中与耐药相关的氨基酸突变。

        原理

        用 PCR 扩增 HIV 样品基因片段(gag、env 和 pol),并对扩增的目的片段进行基因测序,将测序结果进行比对,以此确定是否存在耐药变异。

        用途

        PCR 检测艾滋病患者感染 HIV 病毒的 gag、env 和 pol 基因变异情况,为 HIV 的预防和治疗提供参考。

        材料与仪器

        PCR 仪、PCR 缓冲液、dNTP 混合物

        HIV 的 cDNA、TaqDNA 聚合酶

        去离子水、DNA 纯化回收试剂盒

        PCR 引物、电泳仪

        步骤

        通过 PCR 法检测 HIV 耐药的步骤如下:


        1、设计引物:选取需要扩增的基因片段(gag、env 和 pol)设计引物;


        2、准备无菌的 10 μL、200 μL、1000 μL 枪头、PCR 管;


        3、向 PCR 管中加入 1 μL 的(2.5 mM)4×dNTPs 混合物、5 μL 的 10×PCR 缓冲液、5 μL 的(25 μM)MgCl2、1 μL 上游引物(10 μM)、1 μL 下游引物(10 μM)、0.2 μL TaqDNA 聚合酶、3 μL 的 HIV cDNA,剩余的加去离子水补足到 50 μL,然后混匀;


        4、设置第一轮巢式 PCR 反应程序:95 ℃ 预变性 3 min,95 ℃  变性 30 s,55 ℃  退火 30 s,72 ℃ 延伸 1 min,变性、退火、延伸三个操作进行 35 个循环,72 ℃ 终延伸 5 min,4 ℃ 保存;


        5、第二轮巢式 PCR 反应:向 PCR 管中加入 1 μL 的(2.5 mM)4×dNTPs 混合物、5 μL 的 10×PCR 缓冲液、5 μL 的(25 μM)MgCl2、1 μL 上游引物(10 μM)、1 μL 下游引物(10 μM)、0.2 μL TaqDNA 聚合酶、5 μL 的第一轮巢式 PCR 产物,剩余的加去离子水补足到 50 μL,然后混匀;


        6、设置第二轮巢式 PCR 反应程序:95 ℃ 预变性 3 min,95 ℃  变性 30 s,55 ℃  退火 30 s,72 ℃ 延伸 1 min,变性、退火、延伸三个操作进行 30 个循环,72 ℃ 终延伸 5 min,4 ℃ 保存;


        7、PCR 产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳,鉴定正确后用 DNA 凝胶纯化回收试剂盒进行纯化回收,用于 PCR 扩增和测序;


        8、将获得的 HIV 的 PCR 产物送去测序,将测序结果与野生型序列进行比对,判断是否有耐药相关基因突变。

        注意事项

        引物结合位点可能出现多位点结合,可能会降检测的准确性 ;实验材料要保证无菌,避免 PCR 反应污染。

        常见问题

        (1)电泳产物出现多条条带。


        (2)模板、引物质量不好。

        来源:丁香实验

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