内皮细胞屏障的通透性检测

内皮屏障功能的变化可调控血管向组织的渗漏，以维持稳态。内皮细胞通透性改变在多种疾病的病理生理过程中具有重要的意义，目前已建立了一系列体内外内皮细胞屏障通透性的检测方法。

伊文思蓝是一种常用的偶氮染料，与血浆白蛋白有很高的亲和力，可用来标记白蛋白。在生理条件下，内皮不能渗透白蛋白；而在病理条件下，内皮细胞间连接蛋白功能障碍导致屏障通透性增加，此时，可在单层内皮细胞模型中检测到伊文思蓝-白蛋白的渗漏。

在体内及体外模型中评估内皮屏障的通透性。

1. 单层细胞屏障建立： 细胞消化、计数并调整细胞浓度至 1×10⁵ 细胞/mL，移液器取 1 mL 细胞悬液接种于孔径为 3 μm 的 Transwell 小室中，并将小室插入 24 孔细胞培养板，培养板下室提前加入 1 mL 完全细胞培养基，置于 37 ℃，5% CO₂ 细胞培养箱中，每两天使用细胞电阻仪测量一次跨膜电阻（TEER）并记录数值，至 TEER 稳定且持续时，认为单层细胞屏障形成；

2. 伊文思蓝-血清白蛋白（EB-BSA）工作液配制：2% EB 贮存液与 60 倍体积的 4% BSA 混合，用 PBS 稀释至终浓度为 0.67 mg/mL；

3. 伊文思蓝渗漏测定：取出 Transwell 小室，PBS 洗 2 次后，放入新的 24 孔板，下室加入 600 μL 4% BSA 溶液，上室加入 100 μL EB-BSA 工作液，以保证上室与下室液面高度一致，消除液面高度差引起的液体渗漏，于 37 ℃，5% CO₂ 细胞培养箱中平衡 1 h；

4. 渗透性评估：① 取出 Transwell 小室，吸取下室液体于 1.5 mL EP 管中，1 000 rpm 离心 5 min，取 200 μL 加入 96 孔板；② 另将 EB-BSA 工作液（初始浓度为 0.67 mg/mL）倍比稀释，分别取 200 μL 加入 96 孔板，使用多功能酶标仪在 620 nm 波长下测量 OD 值并制作标准曲线；③ 根据标准曲线计算 Transwell 下室液体中 EB 浓度，该浓度代表由上室渗漏至下室的伊文思蓝的含量，即单层内皮细胞的通透性。

1. 根据实验需要可选择不同孔径的 Transwell 小室，常用 0.4 μm~3 μm 孔径；

2. 造模前需确认屏障的完整性，可通过跨膜电阻（TEER）检测评估完整内皮屏障的形成；

3. 检测 EB-BSA 渗漏时，需保证 Transwell 上室及下室液面一致，避免因液体高度差所引起的渗漏。

1. 推荐接种的细胞密度是多少？

不同的实验使用细胞种类不同，培养时间和方法亦有区别，建议参考文献。

2. 是否需要对小室膜进行包被，如胶原蛋白包被？

一般来说，若细胞在 TC 处理表面的培养器皿中进行培养时贴壁状态良好，则不需要对小室膜进行额外的包被处理。只有在细胞贴壁状态不好，并且在之前的培养中都需要进行包被，才需要对小室膜进行包被，但请注意包被层可能会影响到后续物质交换，建议参考相关文献。

3. 内皮细胞在 Transwell 小室中生长不均匀。

为优化细胞在 Transwell 小室上的生长，应避免培养瓶接种培养细胞后，底部细胞覆盖率超过 85%~90%；完成细胞接种后，务必小心地将 Transwell 板转移至培养箱中。避免将含有悬浮细胞的培养基从 Transwell 小室泄漏至培养板中。

4. TEER 值不稳定。

在进行单层内皮细胞模型的 TEER 测定之前，将小室平衡至室温，可以获得更为统一的测定结果，不同内皮细胞平台期 TEER 值也不尽相同；请注意上室与下室中液体的体积会影响测定数值，请严格统一每次测量时的工作体积。