🔥 活细胞 FRET 分析

作为一种高效的光学「分子尺」，荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是采用物理方法去检测分子间的相互作用的方法，是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移，即发生能量共振转移。

FRET 程度与基团质检的空间距离紧密相关，一般为 7~10 nm 时即可发生 FRET；随着距离延长，FRET 呈显著减弱。基团之间 FRET 的效率，可以由 E = 1/1 +（R/R0）exp6 反映，其中 R 表示基团之间的距离，R0 表示福氏半径，依赖荧光基团发射谱和淬灭基团激发谱的重叠程度，以及基团能量转移的偶极子的相对方位。

适用于在细胞正常的生理条件下，验证已知分子间是否存在相互作用，比如细胞内分子间的相互作用、膜蛋白的研究、细胞膜受体蛋白间的相互作用、细胞凋亡的研究、核酸检测等。

以荧光物质 CFP（供体）-YFP（受体）为例，检测 AB 蛋白在细胞内的相互作用。

1、细胞转染：构建质粒载体 CFP-A 和 YFP-B，将检测的 AB 蛋白分别偶联上荧光蛋白 CFP 和 YFP，并将两个质粒共转染到培养的细胞内；

2、转染 24 小时后，去除培养基，并用 4％ 的多聚甲醛固定细胞 15 分钟，用 PBS 洗涤两次；

3、FRET 图像采集：确定 FRET 配对的激发波长，蓝光被调谐分别用于探测最大和最小的供体和受体信号，其中最大供体信号和最小受体信号对应的波长用于收集双表达细胞的 FRET 信号。调整激光变化以便获取最大 CFP 信号和最小 YFP 信号的激发光波长，采集供体和受体图像，收集 FRET 信号。每个细胞 FRET 检测重复 3 次，每种转染至少完成 6 个细胞的 FRET 检测;

4、FRET 数据处理：对于图像分析和系数计算，每张图片要减去背景，去除 FRET 信号中 DSBT 和 ASBT 的光谱串色信号；另外受体通路的 FRET 信号需要对供体受体光谱灵敏度的变化进行矫正、对自发荧光和光学噪声进行矫正；同时利用矫正系数对双标定细胞进行像素匹配矫正。

1. 供体荧光基团和受体荧光基团的空间距离要 <10 nm，足够接近；

2. 供体的发射光谱与受体的接收光谱要有相当的重叠；

3. 能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列。