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        🔥 对硝基酚磷酸钠法

        相关实验:酸性磷酸酶活性测定

        别名:酸性磷酸酶活性测定

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 孙汉寅硕士

        生物与医药学 中国科学院大学

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        审核专家 | 黄玥琳博士

        生理学 大连医科大学

        简介

        酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)广泛存在于各种细胞中,在部分癌细胞中酸性磷酸酶往往会异常表达。以对硝基酚磷酸钠作为酸性磷酸酶反应底物,在碱性条件下能够水解生成黄色的对硝基酚,通过比色测定即可对 ACP 进行定量分析。

        用途

        用以测定组织或细胞中 ACP 的水平。

        材料与仪器

        组织或细胞,RIPA(中弱)裂解液,对硝基酚磷酸钠溶液,缓冲液

        分光光度计,恒温水浴锅,剪刀,研钵,试管等

        步骤

        1. 取细胞沉淀或组织,加入 RIPA 裂解液,使用剪刀或研钵对细胞或组织进行充分裂解(置于冰上),将裂解液收集至离心管中,4 °C 下 15000 rpm 离心 15 min,收集上清液,此时上清液中包含酸性磷酸酶。

        2. 加入缓冲液和对硝基酚磷酸钠溶液。取少量上清液,加 ddH2O 进行稀释(稀释约 5~10 倍),向阴性对照组(无酸性磷酸酶组)与测定酶活组加入的缓冲液与对硝基酚磷酸钠溶液等量。混匀后,在 37 °C 恒温水浴锅中保温反应 10~15 min,每5min摇动一次,反应结束后,加入 0.5 M NaOH 溶液终止反应。此时 pH = 14,取 1 mL 液体在分光光度计 400 nm 下测试吸光度。

        3. 酶活性 🔥 对硝基酚磷酸钠法 (V:酶的体积,V1:每次用酶的体积)

        注意事项

        1. 反应要在冰上进行,全程保持低温操作。

        2. 提取得到的酶应该立刻进行反应,保存于 -20 °C 也要尽快进行试验。

        3. 加入 NaOH 后,对硝基酚呈现黄色。

        来源:丁香实验

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