蛋白质磷酸化

磷酸化修饰是蛋白翻译后修饰方式之一，多发生在蛋白多肽链的苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸的羟基上，影响着蛋白活性状态，参与了机体多种生理病理过程，蛋白质磷酸化位点的鉴定和分析已成为蛋白组学研究的重要组成部分。

蛋白磷酸化位点的鉴定和蛋白质磷酸化状态的分析

1、步骤见 Western blot；

2、步骤见 ELISA；

3、步骤见原 protocol。

1、Western blot

①细胞或组织样品要在含有新鲜磷酸酶抑制剂的裂解液中匀浆，样品裂解过程中需持续置于冰上或维持在 4℃；

②使用 5% w/v BSA 而非脱脂奶粉封闭 PVDF 膜（牛奶中含酪蛋白，抗体会检测出导致高背景，同时酪蛋白是一种磷酸化蛋白）；

③磷酸化可能需要被诱导（信号弱或无信号可能意味诱导不充分，建议设置阳性对照）。

2、ELISA

初始捕获抗体和磷酸化状态无关，目的蛋白结合在抗体包被的分析板上后加入待分析的特异性位点磷酸化检测抗体，产生的信号强弱与初始样品中特异性位点磷酸化蛋白的浓度呈正比。

3、质谱

①影响检测准确度：磷酸化修饰肽段丰度相对于整体样本是很低的，有效富集磷酸化肽段能降低非磷酸化肽段形成的高背景信号；

②磷酸基团取代方法中，巯基乙醇取代磷酸基团交联生物素后由亲和色谱柱分离的方法仅适用于丝氨酸和苏氨酸的磷酸化检测，而通过化学反应在磷酸基团上连接半胱胺基团，修饰的磷酸肽用固相化碘乙酰凝胶提取的方法适用于各种氨基酸的磷酸修饰。