🔥 蛋白质甲基化

甲基化修饰是蛋白翻译后修饰方式之一，多发生在蛋白多肽链的精氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、天门冬酰氨、谷酰胺、谷氨酸、组氨酸和半胱氨酸上，或者蛋白质的 N 末端或 C 末端，研究最多的甲基化类型发生在蛋白多肽链的赖氨酸和精氨酸上，参与调控多种生物学过程，与衰老、癌症、老年痴呆等许多疾病息息相关。蛋白质甲基化位点的鉴定和分析已成为蛋白组学研究的重要组成部分。

蛋白质甲基化位点的鉴定和分析

1、蛋白抽提

1.1 从培养箱中取出待提取的细胞，用吸引器洗掉培养基后，将培养皿置于冰上；

1.2 往培养皿中加入适量的裂解液，并加入相应量的蛋白酶抑制剂，一般来说，12 孔板加入100μL 裂解液，6cm 皿加入 300-400μL 裂解液，晃动培养皿，使得裂解液流过细胞表面；

1.3 在冰上用细胞刮将细胞刮离培养皿，并收集到 1.5mL EP 管中；

1.4 在冰上超声破碎细胞（根据仪器的功率调节），一般超声 10-15 下即可；

1.5 超声好的细胞放入离心机中，12000g，4℃，离心 15 分钟；

1.6 离心完后，取出 EP，小心地将上清液转移至一干净的 EP 管中，待用。

2、凝胶或溶液内蛋白酶切（以胶内水解为例）

3、甲基化肽段富集（以强阳离子交换柱层析为例）

3.1 装柱：取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；用水冲洗层析柱 3-5 次，每次 10ml 去离子水；根据需要用移液器取出 3-5ml 的填料进行装柱；用去离子水冲洗填料；

3.2 加样：使用缓冲液（PH7.6）平衡 Ni 柱，直至流出液的pH为7.6；对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合，上样量为交换剂交换总量的 1%-5%。

3.3 洗脱：用缓冲液（PH7.6）过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的 OD 值接近为止，流出液取 20μL 做 SDS-PAGE 检测；采取连续梯度洗脱，具体的洗脱梯度根据实验自行调整。

4、HPLC 肽段分离

4.1 肽段分离在 Agilent 1200 HPLC 上进行，检测波长：紫外 210nm 和 280nm；流速：0.3ml/min，非线性二元梯度：

4.2 0-5 分钟丢弃，6-45 分钟每 4.5 分钟收集 1 管，46-50 分钟收集成 1 管，总共 10 管样品溶液，然后将每管溶液彻底冷冻干燥；

4.3 将阳离子交换分离后冻干的多肽样品重新溶解于 Nano-RPLC Buffer A 中；

4.4 在线 Nano-RPLC 液相色谱在 Eksigent nanoLC-Ultra™ 2D 系统（AB SCIEX）进行，溶解后的样品以 2µL/min 的流速上样到 C18 预柱上（100µm×3cm，C18, 3µm, 150Å），然后保持流速冲洗脱盐 10min；

4.5 分析柱是 C18 反相色谱柱（75μm×15cm，C18-3μm，120 Å，ChromXP Eksigent），实验所用梯度为 70min 内流动相 B 由 5% 升高至 35%。

5、串联质谱分析

质谱采用 TripleTOF5600 系统（AB SCIEX）结合纳升喷雾 III 离子源（AB SCIEX, USA），喷雾电压为 2.5 kV，气帘气压为 30PSI，雾化气压为 5PSI，加热器温度为 150°C，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下（IDA，Information Dependent Analysis），一级 TOF-MS 单张图谱扫描时间为 250ms，每次 IDA 循环下最多采集 35 个电荷为 2+ 到 5+ 且单秒计数大于 150 的二级图谱，每次循环时间固定为 2.5 秒，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离（CID），动态排除设置为 18 秒，约等于色谱半峰宽。

6、甲基化位点数据分析

将质谱数据结合生物信息学分析对甲基化位点等信息进行解析，从质谱原始数据出发，进行峰对齐、峰面积提取、总离子流归一化，差异峰 ROC 分析、Segmentation 聚类分析等。

PVDF 或者 NC 膜上的蛋白不能进行质谱检测

1、用于质谱检测的蛋白溶液中蛋白量的要求，混合蛋白溶液蛋白总量最好不少于 50μg；

2、用于质谱检测的蛋白溶液样品溶剂要求 SDS 含量低于 0.1%；

3、纯化后蛋白可以直接使用蛋白溶液进行检测吗？

不可以，抗体纯化蛋白未经过 SDS-PAGE 分离，抗体会发生干扰。