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        同时检测2,3或4个荧光蛋白的其他方法

        相关实验:荧光报告蛋白的多参数流式细胞术

        最新修订时间:

        简介

        同时检测 2,3 或 4 个荧光蛋白的其他方法是由于 ECFP,EGFP,EYFP 和 DsRed 具有较宽的激发和发射波谱,可以利用不同的手段来检测不同组合的荧光蛋白的方法。

        材料与仪器

        器材:

        ① 流式细胞仪,配置如下:

        (1)488 nm 的激发波长作为一级激光器,407 nm 作为二级或三级激光器。

        (2)检测光学装置:488/10 nm 带通滤光片,470/20 nm 带通滤光片,510/20 nm 带通滤光片,550/30 nm 带通滤光片,610/20 nm 带通滤光片,525 nm 短通二色棱镜,及 610 nm 短通二色棱镜(伯瑞特波罗,佛蒙特州)。

        (3)激光内或激光间的补偿。

        ② 校准微球。

        试剂:

        ① Sp2/0-Ag14 细胞(美国典型培养物保藏中心,马纳萨斯,弗吉尼西,目录号. CRL-1581);

        ② 含有逆转录病毒载体的 GP+E-86 上清,病毒载体中含有 ECFP,EGFP,EYFP,或 DsRed 荧光蛋白基因以及新霉素抗性基因(neo 基因);

        ③ 0.45 μm 无菌滤膜;

        ④ 海美溴铵(聚凝胺):配置 1 mg/ml 的储存液,过滤,4 ℃ 保存;

        ⑤ 遗传霉素 Geneticin(G418):配置 40 mg/ml 的储存液,过滤,分装,- 20 ℃ 保存;

        ⑥ Sp2/0-Ag14 的培养基:Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)加高浓度葡萄糖,及 5%(体积比)胎牛血清;

        ⑦ GP+E-86 的培养基:Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)加高浓度葡萄糖,及 10%(v/v)胎牛血清;

        ⑧ 分析缓冲液:PBS + 2%(v/v)胎牛血清。

        步骤

        同时检测2,3或4个荧光蛋白的其他方法基本过程可分为以下几步:

        A.

        荧光蛋白的激发和发射波谱

        最大激发波长(nm)

        最大发射波长(nm)

        ECFP

        434

        477

        EGFP

        489

        508

        EYFP

        514

        527

        DsRed

        558

        583

        B. 可行的激发波长(nm):

        (1)ECFP:407,413 或 458

        (2)EGFP:458 或 488

        (3)EYFP:458,488 或 514

        (4)DsRed:488,514,531 或 568

        C. 可使用的检测光学装置(nm)

        (1)ECFP:470/20 或 485/22 带通滤光片。

        (2)EGFP:510/20 或 530/30 带通滤光片。

        (3)EYFP:530/30,546/20,或 550/30 带通滤光片。

        (4)DsRed:585/42 或 610/20 带通滤光片。

        (5) 二色分光棱镜可以用来分离一些波长:500-长通滤光片、525、560、或 610 的短通滤光片。

        (6) 用于散射的滤光片:带通滤光片来捕捉(主要的)激发波长。

        (7) 必要的激光限制波段或陷波滤光片。

        D. 可用的检测设置:

        组合

        激发波长(nm)

        EGFP/EYFP

        488

        EGFP/DsRed

        488

        EYFP/DsRed

        488

        ECFP/EGFP/EYFP

        458

        ECFP/EYFP/DsRed

        488

        ECFP/EYFP/DsRed

        514(一级)和413(三级)

        ECFP/EGFP/EYFP/DsRed

        458(一级)和568(三级)

        来源:丁香实验

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