简介
掌握比色法测定过氧化物酶活性的原理及方法。
原理
过氧化物酶(POD)催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醍类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚(即愈创木酚)为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，该物质可用分光光度计在470 nm处测定其吸光值，即可求出该酶的活性。其反应为：
材料与仪器
材料:水稻根系、马铃薯块茎等。
试剂：
（1）0.1 mol · L-1 Tris-HCl 缓冲液(pH 8.5)：取 12.114 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris),加 水稀释，用 HCl 调pH 8.5后定容1000 mL。
（2）2 mol · L-1 磷酸缓冲液(pH 6. 0):
贮备液 A：0.2 mol · L-1 NaH2PO4 溶液(27.8 g NaH2PO4 · H2O 配成 1000 mL)。
贮备液 B：0.2 mol · L-1 Na2 HPO4 溶液(53. 65 g Na2 HPO4 · 7H2O 或 71.7 g Na2HPO4 · 12H2 O 配成 1000 mL ) o
分别取贮备液A 87.7 mL与贮备液B 12.3 mL充分混匀并稀释至200 mL。
反应混合液：取 2 mol・L-1磷酸缓冲液(pH 6.0) 50 mL、过氧化氢0.028 mL、愈创木酚0.019 mL混合。
3.器材：分光光度计，移液管，离心机，秒表，研钵，天平等。
步骤
过氧化氢酶（CAT）活性的测定的基本过程可分为如下几步：
1. 酶液提取：取不同水稻根系（根系表面水分吸干）1 g，剪碎置于研钵中，加5 mL 0.1 mol · L-1 Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）,研磨成匀浆，以4000 r・min-1离心5 min,倾出上清液，必要时残渣再用5 mL缓冲液提取一次，合并两次上清液，保存在冰箱（或冷处）备用。
2. 取光径1 cm比色杯2个在其中1个中加入反应混合液3 mL和磷酸缓冲液1 mL（或加热煮沸5 min的酶液），作为校零对照，另1个中加入反应混合液3 mL,上述酶液1 mL（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，用分光光度计在波长470 nmT测量吸光度值， 每隔1 min（60 s）读数1次共测3 min。
3. 结果计算：以每分钟光密度变化（以每分钟人以A470为 0.01个活力单位）表示酶活性大小，即
式中：A470—反应时间内吸光度的变化；
Vt一粗酶提取液总体积，mL；
V1一测定用粗酶液体积，mL；
FW—样品鲜重，g;
0.01—A470 每下降0.01为1个酶活单位，U；
t一反应时间，min。
注意事项
1. 酶的提取、纯化需在低温下进行。
2. H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。
3 .酶促反应较快，计时应准确、快速。
来源：丁香实验
