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        植物组织种丙二醛含量的测定

        相关实验:植物组织种丙二醛含量的测定

        最新修订时间:

        简介

        了解丙二醛(malondialdehyde, MDA )在生物体形成的因素;重点掌握MDA测定的原理和测定方法;进一步熟悉和掌握分光光度计和离心机的使用方法和注意事项。

        原理

        丙二醛(MDA)是膜脂过氧化分解的最终产物之一,其含量可以反映膜脂过氧化的程度。同时,MDA在生物体内积累还会对细胞膜造成进一步的伤害,所以MDA的含量可以反映生物体衰老和遭受逆境伤害的程度。

        植物组织中的MDA在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(TBA)产生显色反应,反应产物为粉红色的3,5,5-三甲基噁哩2,4-二酮。该物质在532 nm波长下有吸收峰。由于硫代巴比妥酸也可与其他物质反应,并在该波长处有吸收,为消除硫代巴比妥酸与其他物质反应的影响。在丙二醛含量测定时,同时测定600 nm下 的吸光度,利用532 nm与600 nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。

        材料与仪器

        材料:4种菠菜样品,即室温对照处理的绿色叶片和黄色叶片,高温处理的绿色叶片和黄色叶片。

        试剂:0.05 mol · L-1 pH 7.8磷酸钠缓冲液;石英砂;

        5% 三氯乙酸溶液:称取5 g三氯乙酸,先用少量蒸個水溶解,然后定容到100 mL;

        0.5% 硫代巴比妥酸溶液:称取0.5 g硫代巴比妥酸,用5%三氯乙酸溶解,定容至100 mL。

        器材:分光光度计,离心机,水浴锅,天平,研钵,剪刀,5 mL刻度离心管

        10 mL刻度试 管,镣子,5 mL、2 mL、1 mL移液管,冰箱。

        步骤

        植物组织种丙二醛含量的测定的基本过程可分为如下几步:

        1. 丙二醛的提取:取5 g样品,加入2 mL预冷的0. 05 mol · L-1 pH 7.8的磷酸缓冲液,加入少量石英砂,在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆,转移到5 mL刻度离心试管中,将研钵用缓冲液洗净.清洗液移入离心管中,最后用缓冲液定容至5 mL。在4 500 r · m-1条件下离心10 min。上清液即为丙二醛提取液。

        2. 丙二醛含量测定:吸取2 mL的提取液于刻度试管中,加入5% 硫代巴比妥酸溶液 3 mL,于沸水浴上加热10 min,迅速冷却。于4500 r · min-1离心10 min 取上清液于532、 600 nm波长下,以蒸憎水为空白调透光率100%,测定吸光度。

        3 .结果计算:

        植物组织种丙二醛含量的测定

        式中以一吸光度;

        V1 —反应液总体积,4 mL;

        V一提取液总体积,5 mL;

        V2一反应液中的提取液体积,2 mL;

        W一植物样品重量,0.5 g;

        1.55X10-1—丙二醛的微摩尔吸光系数(在1 L溶液中含有1 μmol 丙二醛时的吸光度)。

        注意事项

        1. 1%~0. 5% 的三氯乙酸对MDA-TBA反应较合适,若高于此浓度,其反应液的非专一性吸收偏高。

        2. MDA-TBA显色反应的加热时间,最好控制在沸水浴10~15 min。时间太短或太长均会引起532 nm下的光吸收值下降。

        3. 如用MDA作为植物衰老指标,首先应检验被测试材料提取液是否能与TBA反应形成532 nm处的吸收峰。否则只测定600 nm两处A值,计算结果与实际情况不符,测得的高A值是一个假象。

        4. 在有糖类物质干扰条件下(如深度衰老时),吸光度的增大,不再是由于脂质过氧化产 物MDA含量的升高,而是水溶性碳水化合物的增加,由此改变了提取液成分,不能再用 532 nm、600 nm两处A值计算MDA含量,可测定510、532、560 nm处的A值,用A532 -(A510-A560 )/2的值来代表丙二醛与TBA反应液的吸光值。

        来源:丁香实验

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