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        固定抗血清-稀释病毒法中和试验

        相关实验:中和试验

        最新修订时间:

        简介

        中和试验(neutralization test)是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物,使病毒与抗体相互反应,再将混合物接种到敏感的宿主体内,然后测定残存病毒感染力的一种方法。凡是能与病毒结合,并使其失去感染力的抗体称为中和抗体,因为病毒要依赖于活的宿主系统复制增殖,因此,中和试验必须在敏感的动物体内(包括鸡胚)和培养细胞中进行。
        固定抗血清-稀释病毒法用中和试验方法鉴定病毒时,将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清(20 个抗体单位/单位体积)混合、孵育,使两者充分反应,然后将混合液接种到敏感宿主体内,观察试验结果。

        原理

        中和试验的基本原理是特异性的抗病毒抗体(中和抗体)与病毒结合之后,使病毒失去吸附、穿入宿主细胞的能力,从而阻止了病毒在宿主细胞内的复制和病毒感染机体的过程。进行中和试验时,首先将病毒与抗体在适当的条件下混合、孵育后,接种给敏感宿主,然后观察病毒感染敏感宿主的情况,即观察残存的病毒对宿主的感染力。用敏感动物进行中和试验时,主要观察抗体能否保护易感动物免于死亡、瘫痪;用细胞培养法进行中和试验时,主要观察抗体能抑制病毒的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)或病毒空斑形成(virusplaque formation)等;用鸡胚接种法进行中和试验时,主要通过观察绒毛尿囊膜上的痘疮结构来检测病毒,或用血凝试验检测鸡胚尿囊液流感病毒的滴度。

        材料与仪器

        器材:


        ①一次性无菌手套


        ②培养箱


        ③注射器


        ④细菌滤器


        试剂:


        ①宿主:敏感细胞、敏感动物、鸡胚;


        ②已知标准的抗病毒血清(20 个抗体单位/0.1 mL)和已知阴性血清(56℃30 分钟灭活);


        ③病毒分离物

        步骤

        固定抗血清-稀释病毒法中和试验的基本过程可分为如下几步(以细胞培养为例):


        ①用细胞维持液连续 10 倍稀释病毒分离物(10-8~10);


        ②取 0.6 mL 不同浓度的病毒稀释液与 0.6 mL 标准的抗病毒血清混合;


        ③再取 0.6 mL 不同浓度的病毒稀释液与 0.6 mL 已知的阴性血清混合;


        ④将混合液置 37 ℃ 水浴 1 小时,然后取 0.2 mL 混合液分别接种于细胞已长成单层的 96 孔细胞培养板中,每一稀释度接种 5 孔,设 5 孔正常细胞对照;


        ⑤将细胞培养板置 37 ℃、5%CO2 温箱中孵育,每日观察细胞病变效应 (CPE)。


        ⑥中和试验的病毒 CCIDso 的计算:细胞培养中,通常是以病毒的组织半数感染量(CCIDsd/单位体积)作为中和反应的终点。而动物试验中,用动物半数致死量(LDso/单位体积)作为中和反应的终点。中和试验中,抗血清组的 CCIDs。与阴性血清组的 CCID50 对数之差等于或大于 2,才能说明中和试验结果为阳性。

        注意事项

        (1)病毒悬液:低温保存,多次分装,避免反复冻存。


        (2)抗血清:常需要在 56 ℃ 灭活 30 分钟,避免一些非特异性物质增强抗体中和作用,和灭活病毒。


        (3)孵育温度和时间:37 ℃ 1 小时。

        来源:丁香实验

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