人外周血树突状细胞 MACS 法分离

相关实验：人外周血树突状细胞的分离

最新修订时间：2022-08-19

简介

树突状细胞（dendritic cell，DC）是一种贴壁细胞，它在脾脏贴壁细胞中所占的比例小于 1%，细胞轮廓不规则，具有树枝状的突起。DC 不但存在于脾脏等外周淋巴器官中，也存在于外周血中。为了在体外研究 DC 的功能，需要对体内的 DC 细胞（主要是外周血、脾脏、淋巴结）进行分离、纯化。

分离纯化 DC 的方法主要有两种：基于细胞物理性状的分离方法（如贴壁法）和基于细胞表面标记的分离方法（如 MACS 和 FACS 分离法）。

原理

MACS 法人外周血树突状细胞的分离的基本原理是根据人树突状细胞表面表达的相对特异性表面标志，将包被了磁珠的抗体与淋巴组织、血液或非淋巴组织细胞悬液共孵育并置于磁场后，结合了相应抗体的细胞将留在分选柱中，脱离磁场后可分离得到相应的 DC。

不同组织来源的人源 DC 具有不同的特征。例如，CD141（BDCA-3）表达于人外周血中占很小一部分的 CD11^cimCD123 CD1^c（BDCA-1）CD4^＋髓系 DC（约占所有外周血单个核细胞的 0.04%），而 CD1^c（BDCA-1）则可用于分选人外周血中占绝大部分的 CD11^chighCD123^low 髓系 DC（约占所有外周血单个核细胞的 0.6%）。

另外 DC-SIGN 则用于分离分布于皮肤、黏膜，以及淋巴组织包括扁桃体、淋巴结、脾脏等处的 DC。DC-SIGN 也表达于单核细胞来源的 DC，但不表达于外周血 DC 亚群。因此，可根据实验需要选择合适的分选方式。这里介绍两步法分离外周血中成熟的 DC（其主要特征是高表达 CD83）。

材料与仪器

试剂：

抗凝人外周血、包被磁珠的单抗（包括抗 CD3、CD14、CD19 和 CD56）、CD83-PE、包被磁珠的抗 PE 抗体、预冷的 PBS、含 2 mmol/L EDTA、1% 胎牛血清、聚蔗糖-泛影葡胺溶液（Ficoll-Hypaque）。

仪器：

磁性分离装置、15 ml 聚丙烯锥底离心管。

步骤

人外周血树突状细胞 MACS 法分离的基本过程可分为以下几步：

（1）Ficoll 密度梯度法（或其他合适的方法）分离人外周血得到单个核细胞。锥虫蓝计数活细胞，用预冷 PBS 调整细胞浓度为 2 x 10 个/ml，置于 15 ml 锥底离心管中。

（2）磁性分离非 DC 细胞：在细胞悬液中加入混合单抗的磁珠（抗 CD3、CD14、CD19 和 CD56），4 ℃，20 分钟后，离心洗涤 2 次，用预冷 PBS 调整细胞浓度至 2 x 10 个/ml，用磁性分离装置分离磁珠包被的细胞。

（3）计数未结合抗体的细胞，用完全 RPMI1640 培养基重悬细胞至 2x107 个/ml。

（4）将单个核细胞悬液铺于 100 mm 细胞培养皿上，每个平皿 10 ml。37℃ 孵育过夜后，收取未贴壁细胞，调整浓度至 1 x 10⁷ 个/ml。