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        细胞同步化实验

        相关实验:细胞周期分析

        最新修订时间:

        简介

        在细胞培养过程中,细胞多处于不同的细胞周期时相中。不同时相的细胞对药物干预存在不同的反应,会影响实验的重复性,因此需要制备细胞周期一致的细胞。


        细胞同步化是解决该问题的好办法。细胞同步化的方法多样,包括温度休克法、短时间饥饿法、药物抑制法以及离心淘洗法等。不同处理使细胞停留在不同的分裂时相中,血清饥饿使细胞停留在G0和G1期;胸苷(thymidine)可使细胞阻滞于S期;有丝分裂摇落法使细胞停止在M期。

        原理

        细胞同步化的基本原理是利用药物或其他方法使细胞停止在细胞周期的某个时相的技术,其基本原则是使细胞停留在细胞周期的特定时相上;停滞过程可以通过调节,恢复细胞周期;恢复后所有细胞以一致的步调在细胞周期中运行。

        用途


        细胞同步化实验为特定细胞周期转变、细胞动力学、细胞周期调控以及细胞在不同时相中对药物的敏感性研究奠定基础。

        材料与仪器

        器材:


        培养瓶;移液器;枪头;小烧杯;10 ml吸管橡皮头;超净工作台;CO2孵育箱;倒置相差显微镜;离心机。


        试剂:


        ①无血清培养基
        ②胎牛血清
        ③RPMI-1640培养液
        ④0.25% 胰蛋白酶溶液
        ⑤PBS

        步骤

        细胞同步化的方法多样,从血清饥饿法、胸苷法(诱导细胞停滞在G1/S期交界)、有丝分裂摇落法(将细胞截获于M期)为例,其基本过程可分为如下几步:

        一、血清饥饿法(将细胞周期阻滞在G0/G1)


        A. 用0.25% 胰蛋白酶消化对数生长期HeLa细胞,收集细胞,600g离心5 min,弃上清液。


        B. 用37 ℃预温pH7.4的PBS或无血清培养基洗涤细胞2次,重悬于培养液中。培养液中血清浓度低于0.5%。


        C. 在CO2孵育箱中37 ℃、5% CO2以及饱和湿度的条件下,培养24~48 h。


        D. 弃去无血清培养基,加入正常血清浓度的培养液,使细胞重新进入细胞周期。细胞约在12 h后进入S期。

        二、胸苷法(诱导细胞停滞在G1/S期交界)


        A. 添加含2 mmol/L胸苷的新鲜培养液于培养对数生长期HeLa细胞的培养瓶中。


        B. 在CO2孵育箱中37 ℃、5% CO2以及饱和湿度的条件下,培养12 h。


        C. 弃去含有胸苷的培养液,用等量的完全培养液洗涤贴壁细胞2次。更换新鲜培养液,在37 ℃的CO2孵育箱中孵育16 h。


        D. 弃去培养液,再加入2 mmol/L胸苷的新鲜培养液,并孵育12~14 h。


        E. 重复C步骤。

        三、有丝分裂摇落法(将细胞截获于M期)


        A. 取覆盖瓶底(汇合度)达70%~80% 的HeLa细胞1瓶,弃去原培养液,用无血清培养液冲洗。然后加入3 ml 0.1% 胰蛋白酶消化5 min。轻扣培养瓶,使松动细胞游离下来。


        B. 600 g离心5 min,并调整细胞浓度至2.5x105个/ml,种入培养瓶,于37 ℃的CO2孵育箱中孵育6 h。


        C. 摇动培养瓶,弃去未贴壁的细胞,更换培养液2次。加入培养液继续培养10 h。


        D. 在10 h结束,轻轻摇动或轻扣培养瓶,收集M期细胞,600 g离心5 min,并用培养液将细胞浓度调整到2.5x105个/ml。


        E. 种入培养瓶,于37 ℃的CO2孵育箱中孵育2 h,细胞进入G1期。
        以上方法可应用流式细胞仪检测获得细胞的细胞周期(见流式细胞仪检测细胞周期)。

        注意事项

        1. 血清饥饿法必须注意无血清培养液处理细胞的时间,时间过长将引起细胞不可逆进入Go期或凋亡。


        2. 有丝分裂摇落法必须注意胰蛋白酶的消化时间,过长的消化时间将引起其他周期的细胞数目增加。

        来源:丁香实验

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