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        尼龙棉柱法分离 B 淋巴细胞

        相关实验:B 淋巴细胞的分离

        最新修订时间:

        简介

        B 淋巴细胞的分离是利用 B 细胞多种生物学特性,如 B 细胞表达 CD19、CD20 分子,具有膜免疫球蛋白等,可将 B 细胞与其他细胞进行分离。

        原理

        尼龙棉柱法分离 B 淋巴细胞的基本原理是利用 T、B 细胞对尼龙棉的不同吸附特性,分离 T 细胞和 B 细胞。尼龙棉柱法分离 B 细胞获得率比较高,但是细胞纯度较差,B 细胞纯度平均只能达到 85.5%。

        材料与仪器

        试剂:

        1. 蒸馏水

        2. 含 20% 小牛血清的 RPMI 1640 培养基

        3. 0.85% 冰冷生理盐水

        4. 0.2 mol/L 盐酸

        5. 分离获得的人外周血单个核细胞或小鼠脾脏来源的单个核细胞


        仪器:


        1. 尼龙棉柱

        2. 50 ml 玻璃注射器

        3. 尼龙棉柱固定支架

        4. 镊子、烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等

        步骤

        尼龙棉柱法分离 B 淋巴细胞的基本过程可分为以下几步:

        1.尼龙棉柱的准备


        (1)将尼龙棉 50 g 浸泡于装有 0.2 mol/L 盐酸的烧杯(操作过程中需戴一次性手套),加热至沸腾 5~10 分钟。

        (2)用大量蒸馏水漂洗 10 遍以上(漂洗至第 10 遍时用 pH 计测其 pH 值以判断是否洗干净),洗净后将尼龙棉摊在铺有纱布的方盘内,37 ℃ 温箱干燥 2~3 天后,贮藏在带盖的方盘内。

        (3)将尼龙毛撕匀,取 50 ml 玻璃注射器,拔去注射芯,在注射器头上套一段带夹子的胶管。用小镊子将其填塞于注射器,约 20 ml 的体积。

        (4)将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好,高压灭菌。

        2.过柱分离细胞


        (1)将 20% 小牛血清的 RPMI 1640 培养基预热至 37 ℃。

        (2)将尼龙棉柱固定在支架上,倒入 37 ℃ 的细胞培养液,关闭阀门一定时间,然后打开阀门,放掉细胞培养液,清洗几次尼龙毛,关上阀门。共需用 25~50 ml 培养液。

        (3)将待分离的细胞液用预先加温的培养液配制成 5x10/ml 的悬液。

        (4)将细胞液加入尼龙棉柱,使之刚没过尼龙毛柱。盖上注射器,37 ℃ 温育 45 分钟至 1 小时。

        (5)打开下口阀门,缓慢放流(1 滴/分钟),可用 5~10 ml 预热的培养基洗柱。收集流出液至离心管,1000 r/min 或 200 g 离心 10 分钟,收集 T 细胞。

        (6)通过锥虫蓝染色检查细胞活力,计数细胞,然后根据需要用 PBS 或合适的培养基将细胞稀释备用。

        (7)关闭尼龙棉柱下口,于柱内加入 0.85% 冰生理盐水,振荡,并套上注射器芯,打开下口,快速推出注射器内液体,即获得黏附于尼龙棉上的 B 淋巴细胞、单核巨噬细胞等。

        注意事项

        1.应根据富集的细胞量选择所用的尼龙棉柱,一般情况下,若分离少于 1.5x10 细胞,需用 12 ml 尼龙棉柱;1.5x10~3x10 细胞,需用 20 ml 尼龙棉柱。

        2.要进一步富集 B 淋巴细胞,可以利用单核巨噬细胞的易于黏附特性,将单核巨噬细胞和 B 细胞分开。

        来源:丁香实验

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