简介
对于癌症病变的组织学分析，在早期可以通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入测定目的细胞的增殖能力，如胃上皮增殖及肠道干细胞向上增殖能力，推测其转化的可能性。由于BrdU掺入受到剂量和时间的影响，也可以使用增殖相关核抗原进行免疫荧光或组化评价组织的增殖情况，如PCNA或Ki67。
原理
免疫组化（荧光）确定上皮增生及细胞浸润的基本原理是在癌症病变早期可以通过 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入测定目的细胞的增殖能力，如胃上皮增殖及肠道干细胞向上增殖能力，推测其转化的可能性。由于 BrdU 掺入受到剂量和时间的影响，也可以使用增殖相关核抗原进行免疫荧光或组化评价组织的增殖情况，如 PCNA 或 Ki67，下面以 Ki67 免疫组化步骤为例（图 8-3-4）。
材料与仪器
器材：
组化笔、湿盒、荧光显微镜或共聚集显微镜、组织切片等。
试剂：
① Ki67 抗体（DAKO，Rat）
② 柠檬酸抗原修复液
③ 羊血清封闭液
④ 一抗稀释液
⑤ FITC 小鼠抗大鼠荧光二抗
⑥ DAPI 核染色荧光抗体
步骤
免疫组化（荧光）确定上皮增生及细胞浸润的基本过程可分为如下几步：
A 组织切片置于二甲苯中浸泡 10 分钟或更久，更换二甲苯后再浸泡 10 分钟以上。
B 无水乙醇中浸泡 3～5 分钟。
C 95% 乙醇中浸泡 3～5 分钟。
D 70% 乙醇中浸泡 3～5 分钟，蒸馏水洗。
E 3% 过氧化氢孵育 10～30 分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。
F 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟。
G 复水的组织切片使用 0.01 mol/L 柠檬酸抗原修复液微波修复或蒸汽修复。
H 用组化笔圈出阳性组织及同片上的阴性对照，血清封闭液室温封闭 30 分钟。
I 吸去多余的血清封闭液，滴加 1:200 稀释于一抗稀释液的一抗，湿盒中 4 ℃ 过夜。
J PBS 洗 3 次每次 5 分钟，滴加 1:200 稀释于 PBS 的荧光二抗，湿盒中避光室温孵育 1 小时。
K 滴加 1:5000 稀释的 DAPI 抗体，继续孵育 10 分钟。
L PBS 洗 3 次每次 5 分钟，15% 甘油/PBS 封片，用指甲油在四个角固定盖玻片，干后用荧光显微镜或共聚集显微镜观察拍照。结果示例如图 8-3-5 所示。
来源：丁香实验
