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        荧光染料CFSE染色法检测B细胞增殖

        相关实验:B细胞增殖的检测

        最新修订时间:

        简介

        荧光染料CFSE,也称CFDA SE(5,6-carboxyflu- orescein diacetate,succinimidylester)即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂,是一种可穿透细胞膜的荧光染料。


        CFSE一旦进入细胞后不能从细胞中释出,也不会被代谢降解,细胞中CFSE含量减少的唯一途径是通过细胞增殖分裂。当细胞分裂时,CFSE标记物可平均地分配到两个子代细胞中。


        因此其荧光强度是亲代细胞的一半。使用CFSE对淋巴细胞进行标记,结合流式细胞技术可以快速、准确地检测某一特定亚群的淋巴细胞的增殖。

        原理

        荧光染料CFSE染色法检测B细胞增殖的基本原理是利用CFSE可以穿过细胞膜与细胞骨架蛋白稳定结合,在胞质内某些酶的作用下水解而发荧光。


        它可以被488 nm的激光所激发,发射波长为510~530 nm,近似于FITC。理论上认为,当细胞分裂时,CFSE被平均分到两个子细胞当中,因此子细胞所带的荧光量为母细胞的一半。


        细胞分裂次数越多,细胞的荧光量越弱。利用FACS技术,将抗体标记与CFSE染色结合,可以测定特定细胞的增殖情况。

        材料与仪器

        试剂:


        1. CFSE
        2. PBS

        3. RPMI 1640完全培养液


        仪器:


        1. 细胞培养箱
        2. 流式细胞仪

        步骤

        荧光染料CFSE染色法检测B细胞增殖的基本过程可分为以下几步:


        1)淋巴细胞的制备:将Balb/c小鼠脱颈断髓处死,无菌分离颌下、双侧腋窝、锁骨下、腹股沟浅淋巴结和肠系膜淋巴结,去掉被膜,于200目不锈钢筛网上研磨、过滤,获得单细胞悬液。


        收集细胞,用冷PBS离心(400 g,6分钟)洗涤细胞2次,悬浮于PBS中,调整细胞密度为2x10细胞/ml。取1 ml细胞悬液加入15 ml离心管中,准备进行CFSE染色。


        (2)CFSE染色:CFSE用DMSO溶解成10 mmol/L的储存液,-20 ℃保存。临用前,取适量用PBS稀释成2 μmol/L的工作液,平衡至室温备用。


        调整淋巴细胞悬液的密度为2x106细胞/ml,加入等体积的CFSE工作液(终浓度为1 μmol/L),充分混匀后在室温条件下轻轻振荡10分钟。


        然后用适量的RPMI1640完全培养液终止反应,离心(400 g,6分钟),洗涤细胞2次,弃上清,悬浮于RPMI 1640完全培养液中,并调整细胞密度为2x106细胞/ml。


        (3)多克隆刺激剂诱导细胞增殖:将上述调整好细胞密度的淋巴细胞悬液接种于96孔培养板中,每孔200 μl。


        加入佛波醇酯类多克隆刺激剂PDB(终浓度2x10-7 mol/L)+钙离子转运剂Ion(1 mg/L)或植物血凝素类多克隆刺激剂Con A(5 mg/L),刺激48小时后进行检测。


        (4)流式细胞术检测淋巴细胞增殖:48小时后,取出培养细胞至流式管中,直接上机检测,检测通道为FL1。


        注意事项

        CFSE的荧光近似于FITC,外标抗体的荧光不能与之重叠。


        来源:丁香实验

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