• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        免疫球蛋白类别转换的诱导和检测

        相关实验:免疫球蛋白类别转换的诱导和检测

        最新修订时间:

        简介

        在免疫应答的过程中,B 细胞接受不同抗原刺激后,可转换表达不同的重链恒定区基因,改变所产生的免疫球蛋白分子(immunoglobulin,Ig)的类型。LPS 可刺激鼠脾 B 细胞发生 IgG2b 和 IgG3 的类别转换。细胞因子能诱导 Ig 向特定的类别发生转换,如 IL-4 和 LPS 共同活化 B 细胞可诱导鼠发生 IgG1 和 IgE 的类别转换,人发生 IgG4 和 IgE 的类别转换。ELISA 的方法可用于检测细胞培养上清中分泌的抗体类别,ELISPOT 方法可以用来检测分泌相应类别抗体的细胞数量,流式细胞术可以检测单个细胞表达相应类别抗体的状况。

        原理

        免疫球蛋白类别转换的诱导和检测的基本原理是 LPS 可刺激鼠脾 B 细胞发生 IgG2b 和 IgG3 的类别转换。细胞因子能诱导 Ig 向特定的类别发生转换,如 IL-4 和 LPS 共同活化 B 细胞可诱导鼠发生 IgG1 和 IgE 的类别转换,人发生 IgG4 和 IgE 的类别转换。ELISA 的方法可用于检测细胞培养上清中分泌的抗体类别,ELISPOT 方法可以用来检测分泌相应类别抗体的细胞数量,流式细胞术可以检测单个细胞表达相应类别抗体的状况。

        材料与仪器

        试剂:


        (1)LPS。


        (2)重组 IL-4。


        (3)含 0.5%BSA 的 PBS,加 0.02% 叠氮钠。


        (4)4% 多聚甲醛。


        (5)抗鼠或人 FcyRIIb 单克隆抗体。


        (6)荧光标记的抗 Ig、抗表面分子抗体。


        (7)Ig ELISA 检测试剂盒、Ig ELISPOT 检测试剂盒。


        (8)B 细胞活化的相关抗原。


        (9)含 10%FCS 的 RPMI 1640 培养液。


        (10)染色缓冲液(含 5%BSA 的 PBS)。


        (11)破膜液(1xPBS+0.1% 牛血清白蛋白+0.05% 叠氮钠+0.1% 皂苷)。
        仪器:48 培养板、96 孔培养板

        步骤

        免疫球蛋白类别转换的诱导和检测的基本过程可分为以下几步:


        (1)细胞培养条件的选择


        1)LPS(40 μg/mL ),诱导 IgG2b 和 IgG3 的类别转换。


        2)LPS(40 μg/mL )+重组 IL-4(5~20 ng/mL),诱导 IgG1 和 IgE 的类别转换。
        3)抗 CD40 抗体/CD40L(10 μg/mL ),诱导 IgG2b 和 IgG3 的类别转换。
        4)抗 CD40 抗体/CD40L(10 μg/mL )+重组 IL-21,诱导 IgG1 和 IgG3 的类别转换。
        5)重组 IL-10(10 ng /mL )+重组 TGFβ(2 ng/mL ),诱导初始 B 细胞分泌 IgG(主要是 IgG1 和 IgG3)以及 IgA(主要是 IgA1 和 IgA2)。
        (2)ELISA 法检测 B 细胞分泌免疫球蛋白的类别
        1)细胞准备:分离人 PBMC 或者小鼠脾脏单个核细胞,纯化 B 细胞。
        2)细胞培养:用 RPMI 1640 培养液调整细胞浓度为 2x10/mL,选取合适的培养条件刺激细胞,取 200 μl 加入 96 孔圆底培养板,每个条件 3 个复孔,37 ℃ 、5%CO2 培养箱中孵育 2~7 天,收集上清,用 ELISA 法检测不同免疫蛋白的含量。
        3)ELISA 法检测 Ig。
        (3)ELISPOT 法检测 B 细胞分泌免疫球蛋白的类别
        1)细胞准备:分离人 PBMC 或者小鼠脾脏单个核细胞,纯化 B 细胞。
        2)包被捕获抗体:用无菌 PBS 稀释捕获抗体,取 100 μl 于 PVDF96 孔板中,4 ℃ 孵育过夜。
        3)封闭:扣弃液体,用无菌 PBS 洗涤 PVDF 96 孔板,350 μl/孔/次,扣弃液体,加入封闭液(含有 1%BSA、5% 蔗糖的 PBS),200 μl/孔,室温静止 2 小时。
        4)细胞培养:用 RPMI 1640 培养液调整细胞浓度为 2x10/mL ,选取合适的培养条件刺激细胞,扣弃液体,取 100 μl 加入 PVDF96 孔板中,每个条件设 3 个复孔,37 ℃ 、5%CO2 培养箱中孵育 16~20 小时。
        5)加检测抗体:弃去培养液,用含 0.05%Tween20 的 PBS 洗涤 4 次,350 μl /孔/次,扣弃液体,用封闭液稀释检测抗体,100 μl /孔,4 ℃ 中孵育过夜。
        6)显色:弃去液体,用含 0.05%Tween20 的 PBS 洗涤 4 次,350 μl /孔/次,扣弃液体,加显色液,100 μl /孔,室温显色 10 分钟。
        7)读取数据:显色结束后,扣弃显色液,用 ddH,2O 洗涤 3/次,晾干板后,用 CLT 读板仪读取数据。
        (4)FACS 法检测 B 细胞分泌免疫球蛋白的类别
        1)细胞准备:分离人 PBMC 或者小鼠脾脏单个核细胞,纯化 B 细胞。
        2)细胞培养:用 RPMI 1640 培养液调整细胞浓度为 2x10/mL,选取合适的培养条件刺激细胞,取 200 μl 加入 96 孔圆底培养板,每个条件 3 个复孔,37 ℃ 、5%CO2 培养箱中孵育 3~4 天。
        3)smlg 的染色:细胞培养结束后,用染色缓冲液洗涤细胞 2 次,在用荧光素标记抗 Ig 抗体标记前,用 100 μl 含有 50 μg/mL 抗人/鼠 FcYR IIb 单克隆抗体的 PBS/BSA 重悬,4 ℃ 孵育 15 分钟,以除去非特异性染色;用荧光素标记的抗 Ig 抗体和其他表面分子抗体(如 CD19、CD25、CD5 等)标记细胞,4 ℃ 孵育 30 分钟。
        4)Ig 的胞内染色:细胞培养结束后,用染色缓冲液洗涤细胞 2 次,再用 PBS 洗涤细胞 1 次,用 PBS 重悬细胞浓度为 2x10/mL,加甲醇/PBS 固定细胞(终浓度为 2%),室温固定 20 分钟;用染色缓冲液洗涤细胞 1 次,加破膜液重悬细胞,4℃ 破膜 2 小时/过夜;用荧光素标记的抗 Ig 抗体和其他表面分子抗体(如 CD19、CD25、CD5 等)标记细胞,4 ℃ 孵育 30 分钟。
        5)流式细胞仪检测:孵育结束后,用 1 mL 染色缓冲液洗涤细胞 1 次,用 200 μlPBS/BSA 重悬细胞,用流式细胞仪检测并分析数据。

        注意事项

        (1)推荐在刺激 B 细胞前纯化初始 B 细胞,以排除其他细胞对刺激的影响。


        (2)实验使用的刺激剂 LPS,其使用浓度与细胞种属有关,一般 C57BL.10、BALB/c 或 CBA 品系小鼠和人的 B 细胞都对 LPS 有反应性,并且刺激时细胞浓度不宜过高,一般控制在 2x105/mL 以下。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序