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        MTT 法检测细胞毒性与增殖实验

        相关实验:MTT 法检测细胞毒性与增殖

        最新修订时间:

        简介

        通过 MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名为噻唑蓝)检测细胞生长、细胞毒性、细胞增殖的常用方法。

        原理

        活细胞中的线粒体中的一些脱氢酶,能够使外源性的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物,而死细胞无此活性。蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,用酶标仪测定 490 nm 波长的吸光度(OD 值)即可定量检测细胞的毒性与增殖情况。细胞增殖与吸光度成正比,细胞毒性与吸光度成反比。若用成熟的试剂盒检测,则测定 570 nm 的吸光值。

        用途

        细胞增殖、细胞毒性的检测。

        材料与仪器

        细胞、 96 孔培养板、移液枪、枪头、15 ml 离心管、PBS、胰蛋白酶、细胞培养基、酶标仪、二甲基亚砜、 MTT

        步骤

        1、根据说明书配制 MTT 溶液,用 PBS 配制终浓度为 5 mg/ml,配制后可适当分装放 -20 ℃ 避光保存。

        2、适当浓度的细胞接种到 96 孔板后按正常实验需求处理。

        3、培养结束后,每孔加入 10 μl MTT 溶液, 37 ℃ 继续孵育 4 h。

        4、小心吸去孔内的上清液(对悬浮细胞要求离心,离心后弃上清液),加入 150 μl DMSO,摇床上低速振荡 10 min,使紫色结晶溶解。在酶联免疫检测仪上,490 nm 波长下测定各孔光吸收值(OD 值),记录结果。

        5、除了 DMSO,还可选择成熟的 MTT 试剂盒检测,则每孔加入 100 μl 结晶溶解液,在细胞培养箱中继续孵育 3~4 小时,至结晶全部融解。测定 570 nm 处的吸光值。

        注意事项

        1. 酶联免疫检测仪测试的 OD 值仅在适当的细胞浓度时与细胞数目呈线性关系。因此,在实验时,必须选择适当的细胞接种浓度,一般 96 孔板每孔 1 000~5 000 个细胞左右,注意接种到培养板后要混匀,防止细胞成团分布不均。

        2. 血清物质会干扰 OD 值,因此,在显色后尽可能将孔内残余培养基吸净。

        3. 设空白对照。与试验孔平行设定不加细胞仅加培养基的空白对照孔,其他实验步骤保持一致。比色时,以空白孔调零。

        4. 96 孔板进行实验时,若培养时间较长需注意蒸发问题。可采取弃用周围一圈,改用 PBS 或培养基替代。

        5. MTT 最好现用现配,避免反复冻融。低温下容易凝固,需融解后再使用。

        6. 测定 OD 值前,需注意细胞孔板中无气泡。

        7. 加入 MTT 生成结晶后,去除上清液需小心不要把结晶去掉。

        8. 结晶一定要完全融解后再测定 OD 值。

        来源:丁香实验

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